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消栓再造丸中非法染色剂苏丹Ⅳ、808猩红的检测方法研究

2025-01-13 101 上传者：管理员

摘要：[目的]建立消栓再造丸中染色剂苏丹Ⅳ、808猩红的检测方法。[方法]采用高效液相色谱法对消栓再造丸中的两种染色剂进行定量测定，色谱柱为Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.6 mm, 5μm）,以乙腈-0.02 mol/L醋酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min,柱温为40℃,检测波长为520 nm。[结果]该方法检测苏丹红Ⅳ、808猩红的线性范围分别为0.001 48～0.029 60μg、0.002 50～0.050 00μg,回收率（n=6）分别为101.68%和101.64%,稳定性实验的RSD分别为0.53%和0.75%。[结论]该方法简单、准确，适用于消栓再造丸中非法染色剂苏丹Ⅳ、808猩红的测定。

关键词：
808猩红
染色剂
消栓再造丸
苏丹Ⅳ
高效液相色谱
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消栓再造丸是由血竭、当归、川芎等38味饮片经粉碎后加炼蜜制成的大处方蜜丸制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中，具有活血化瘀、息风通络、补气养血，消除血栓的功效，主要用于由情志郁怒、饮食不律、过度劳累、气血逆乱，脑脉痹阻所致的中风，其症状表现为肢体偏瘫、半身不遂、口眼歪斜、言语障碍、胸中郁闷等。其处方中的血竭由于价格昂贵，市场供应不足，因此存在造假及伪违的情况，从而影响产品质量，甚至危及患者健康，其中苏丹红IV(C24H20N4O)及808猩红(C23H17N3O2)染色剂为血竭掺伪和造假过程中常用的两种染色剂[1-2]。这两种染色剂均为人工合成的亲脂性偶氮化合物，亲脂性偶氮化合物工业染料被广泛用于溶剂、油、蜡、汽油的增色等，具有一定代谢毒性，在人类或动物体内还原酶的作用下会产生致癌物质，并在累积过程中出现中毒性肝病甚至肝癌[3-4]。苏丹IV及808猩红经常用于制作血竭伪品[5-6],进而传递到消栓再造丸的成品中，产生一定的质量风险。因此，在消栓再造丸中进行两种成分的检测可以降低质量风险，增加产品的可靠性。目前，对于两种成分的检测方式的报道较多，包括高效液相色谱法 (HPLC)、高效液相色谱质谱法 (LC-MS)、气相色谱质谱法 (GC-MS)、薄层层析法、分光光度法、毛细管电泳等[9-15]。《中国药典》2020年版四部指导原则项目中色素测定法指导原则(9303)对色素测定进行了介绍，可用高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法等进行定性和定量鉴别，但目前尚未有对消栓再造丸中染色成分检测方面的研究报道。本研究采用高效液相色谱法对消栓再造丸中可能存在的两种染色剂进行定量和定性分析，方法简单实用、针对性强、检测成本较低，通过制定消栓再造丸成品中两种染色剂的质量控制方法，为监督管理添加非法原料的消栓再造丸提供了更多参考依据。

1、仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(LC-20AT,日本岛津);电子分析天平(十万分之一，XP205型，瑞士Mettler Toledo公司);电子分析天平(万分之一，ML204 型，瑞士Mettler Toledo公司);电子分析天平(百分之一，PL1002E型，瑞士Mettler Toledo公司);超声波清洗器(KQ-250 B型波清洗机，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照试剂：苏丹IV对照品(广州硕谱生物科技有限公司，批号：RMT17610,质量分数以97.8%计)、808猩红对照品(广州硕谱生物科技有限公司，批号：RMT20050,质量分数以99.4%计)。

乙腈为色谱纯(德国Merck公司),甲醇、乙醇、二氯甲烷均为分析纯(北京化工厂);乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司)。

2、实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm);柱温40 ℃;流动相为乙腈(A)-0.02 mol/L醋酸铵(B),洗脱梯度见表1。流速1.0 mL/min; 进样量为10 μL,检测波长520 nm; 理论塔板数按苏丹IV计算不低于2 000。

表1 流动相洗脱梯度

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取苏丹IV、808猩红对照品，加乙醇分别配制成每毫升含18.4 μg和15.68 μg的对照品母液；取以上对照品适量，配制成3.76 μg/mL和2.88 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 阴性供试品溶液的制备

取消栓再造丸1丸，剪碎、精密称定，按质量比1∶1加入硅藻土，充分研磨，置具塞锥形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，超声处理(频率40 kHz, 功率250 W)30 min, 过滤后蒸干，加乙醇到5 mL容量瓶中溶解，摇匀、滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.2 阳性供试品溶液的制备

因消栓再造丸样品中未检测出苏丹IV和808猩红染色剂，因此采用标准品加入法制备阳性供试品，即采用在消栓再造丸原粉中加入配置染色剂后混匀制丸方式制备供试品[5-8]。

苏丹IV阳性供试品溶液：分别精密量取2.3.1项下的供试品溶液1 mL和苏丹IV对照品储备液2 mL,混匀，即得。

808猩红阳性供试品溶液：分别精密量取2.3.1项下的供试品溶液1 mL和808猩红对照品储备液2 mL,混匀，即得。

2.4 专属性实验

分别取上述对照品溶液、阴性供试品溶液、阳性供试品溶液按照2.1项下的方法测定，阴性样品在与对照品溶液相对应的保留时间处没有出现对照峰，阳性样品在与对照品溶液相同的保留时间处出现对应的色谱峰(见图1)。

2.5 线性关系考察

取苏丹IV对照品溶液适量，加入乙醇分别制成每1 mL含苏丹IV 0.148 μg、0.296 μg、0.740 μg、1.480 μg、2.220 μg、2.906 μg的系列标准溶液；精密量取10 μL不同浓度的标准溶液，注入液相色谱仪中，按照2.1项下的色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程：y=33 232x-2 937.1,R2=0.998 6。结果显示，苏丹IV对照品在0.001 48～0.029 60 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(见表2和图2)。

表2 苏丹IV线性关系考察

取808猩红对照品溶液适量，加入乙醇分别制成每1 mL含808猩红0.250 μg、0.500 μg、1.250 μg、2.500 μg、3.750 μg、5.000 μg的系列标准溶液；精密量取10 μL不同浓度的标准溶液，注入液相色谱仪中，按2.1项下的色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程：y=20 273x+591.06,R2=0.999 5。结果显示，808猩红对照品在0.002 50～0.050 00 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(见表3和图3)。

表3 808猩红线性关系考察

2.6 检测限考察

取2.2项下的苏丹IV对照品溶液和808猩红对照品溶液，用乙醇进行逐步稀释(稀释浓度分别见表4和表5),进样10 μL,按照2.1项下的色谱条件，按信噪比3倍值计算，测得苏丹IV检出限(LOD)为0.074 μg/mL(见表4),808猩红的检出限(LOD)为0.125 μg/mL(见表5)。

表4 苏丹IV LOD值

表5 808猩红 LOD值

2.7 精密度实验

按2.3.2项下的方法制备阳性供试品溶液，按2.1项下的色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。苏丹IV峰面积的RSD为1.98%(见表6),808猩红峰面积的RSD为0.65%(见表7),表明实验的精密度良好。

2.8 稳定性实验

取同一阳性供试品溶液，按2.1项下的色谱条件，于制备后0、2、4、8、12、24 h进行测定，记录苏丹IV和808猩红的峰面积，结果为：苏丹IV峰面积的RSD为0.53%(见表8),808猩红峰面积的RSD为0.75%(见表9),表明实验的稳定性良好。

图1 消栓再造丸的HPLC色谱图

图2 苏丹IV的线性关系图

图3 808猩红线性关系图

表6 苏丹IV精密度实验结果(n=6)

表7 808猩红精密度实验结果(n=6)

表8 苏丹IV的稳定性实验

表9 808猩红的稳定性实验

2.9 重复性实验

取同一批次样品，按照2.3.2项下的方法制备6份阳性供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，计算样品中苏丹IV和808猩红的质量浓度。结果为：苏丹IV的RSD为1.23%(见表10),808猩红的RSD为0.44%(见表11),表明实验的重复性良好。

表10 苏丹IV重复性实验结果(n=6)

表11 808猩红重复性实验结果(n=6)

2.10 回收率实验

取同一批消栓再造丸样品，按2.3.2项下的方法制备6份阳性供试品溶液，分别精密量取1 mL已知质量分数的阳性样品，加入2 mL苏丹IV和808猩红对照品溶液，混匀，即得苏丹IV和808猩红回收率样品。按2.1项下的色谱条件检测，计算苏丹IV和808猩红的回收率。结果为：苏丹IV的平均回收率为101.68%,RSD为1.48%;808猩红的平均回收率为101.64%,RSD为1.29%,表明回收率良好(见表12)。

表12 回收率测定结果

3、结束语

3.1 提取方法的考察

消栓再造丸中含有38味中药，以原粉和炼蜜制剂成方，由于原料血竭在整个处方中占比很低，如果不考虑样品的浓缩方法，很可能由于检测限(LOD)的原因影响苏丹IV和808猩红的检测结果。因此，本实验的前处理采用提取试液过滤后浓缩再定容的方式。实验中考察了以甲醇、乙醇、无水乙醇和二氯甲烷为提取溶剂，结果表明：甲醇、乙醇及无水乙醇溶剂在提取过滤蒸干时会出现大量炼蜜粘在蒸发皿中，无法进行定容。二氯甲烷提取过程无这种现象，因此选用二氯甲烷为提取溶剂。本实验对提取方法和提取时间进行了考察，分别超声提取30、40、50 min, 加热回流提取30、60、90 min, 结果表明：超声提取时间为30 min、加热回流时间为90 min时，两种染色剂的峰面积最大，考虑到操作的便捷性与效率，选择时间更短的超声提取方式。

为考察炼蜜对二氯甲烷在提取过程中的提取效率是否有影响，本研究设计了制剂实验，考察蜂蜜对苏丹IV及808猩红染色剂的干扰，即：按照消栓再造丸的生产工艺，取血竭等38味药粉270 g, 加入392 μg/mL的808猩红对照品溶液7 mL和460 μg/mL的苏丹IV对照品溶液6 mL,混匀后取出70 g粉作为未加蜂蜜的供试品组，取已混匀后剩余的200 g粉加入适量炼蜜制成丸剂作为加蜜供试品组。按照2.1项下的检测方法，阴性供试品和阳性供试品的染色剂质量浓度经折算后结果一致，说明蜂蜜对以二氯甲烷为制剂提取样品中的苏丹IV及808猩红染色剂无干扰。

3.2 薄层色谱法的考察

本实验对薄层色谱法进行了研究，实验中阴性样品处理方法同2.3.1,阳性样品处理方法同2.3.2;对照品溶液配置方法为：取苏丹IV、808猩红对照品适量，分别加入甲醇制成每1 mL含苏丹IV、808猩红0.1 mg的溶液，作为对照品溶液；薄层色谱条件为：照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)吸取上述供试溶液2 μL和对照品溶液各5 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂展开，取出，晾干，再以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)为展开剂展开，取出，晾干，日光下视检。在供试品色谱中，在对照药材相对应的位置上不得显出相同颜色的斑点，结果表明，薄层色谱法在考察染色情况时可以作为定性指标参考。

3.3 结论

本研究首次建立了消栓再造丸成品中染色剂的定性及定量检测方法，该方法迅速准确，专属性强。在定性鉴别中，苏丹IV的检出限(LOD)为0.074 μg/mL,808猩红的检出限(LOD)为0.125 μg/mL;在定量测定中，苏丹IV对照品在0.001 48～0.029 60 μg范围内、808猩红对照品在0.002 50～0.050 00 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，检测精度较高。检测方法的苏丹IV峰面积和808猩红峰面积RSD分别为1.98%和0.65%,24 h稳定性实验的RSD分别为0.53%和0.75%,重复性实验的RSD分别为1.23%和0.44%,平均回收率为101.68%和101.64%,均符合要求，说明该方法可用于消栓再造丸成品中苏丹IV和808猩红的定性和定量检测。但是，研究过程中未收集到添加有上述两种染色剂的血竭样品，故未能完全重现染色血竭原粉入药，而是采用了在原粉中加入配置染色剂后混匀制丸方式制备样品进行考察，在后期研究中还需继续进行相关染色样品的收集和检测。

本研究建立的消栓再造丸大蜜丸苏丹IV及808猩红染色剂的定性及定量检测方法，可以有效监测该药品中添加非法染色血竭的行为，为消栓再造丸成品的质量控制提供了更多依据，同时为开发其他蜜丸品种中染色剂成分的检测方法提供了一定借鉴和思路。

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