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连花清咳片对细菌合并烟熏所致的大鼠急性支气管炎的保护作用及机制

2020-06-22 242 上传者：管理员

摘要：目的研究连花清咳片对细菌合并烟熏所致的大鼠急性支气管炎的保护作用及机制。方法建立混合烟熏法同时经鼻滴入卡他莫拉菌复制大鼠急性支气管炎模型。实验分为正常对照组,模型对照组,银黄清肺胶囊对照药组(0.18 g•kg-1)及连花清咳片低、中、高剂量组(1.47、2.93和5.86 g生药•kg-1)。给药组按10 mL•kg-1灌胃给予相应药液,1次•天-1,连续14 d。观察各组大鼠的一般状态;ELISA检测肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α;比色法检测NO、SOD、MDA;流式细胞仪检测肺泡灌洗液中CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例,计算CD4+/CD8+细胞的比例;HE染色观察支气管及肺组织病理学改变。结果与正常对照组比较,模型对照组大鼠肺脏中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平增加,IL-10水平降低,MDA含量增加,NO、SOD含量降低,CD4+/CD8+细胞比值降低;与模型对照组比较,连花清咳片各剂量组大鼠肺脏中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达减少,IL-10的表达增加,MDA含量减少,NO、SOD的含量升高,CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例以及CD4+/CD8+细胞的比值增加。连花清咳片中、高剂量组和银黄清肺胶囊对照药组动物支气管及肺脏病理改变均有明显改善。结论连花清咳片对细菌合并烟熏所致的大鼠急性支气管炎具有显著的保护作用,其机制与降低肺脏组织中炎性因子,抗氧化和提高细胞免疫功能有关。

关键词：
急性支气管炎
抗氧化
炎症因子
细胞免疫
药物
连花清咳片
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急性支气管炎是支气管黏膜的急性炎症，中医学将其归为“咳嗽”，病机主要为肺失宣降、肺气上逆，在治疗上应清热化瘀、宣肺化痰[1]。气道上皮组织在受到大气污染物、病毒、细菌、内毒素等致病因子影响时，其纤毛上皮细胞受损，并伴有相应细胞膜G蛋白受体活化，激活细胞内炎性应激反应，启动下游炎性反应通路，造成急性呼吸道上皮损伤[2,3]。急性呼吸道上皮损伤发生时，早期呼吸道可出现中性粒细胞浸润，释放出大量的炎性因子、氧自由基、蛋白水解酶等。在此作用下，呼吸道上皮可以发生细胞自融、细胞及纤毛坏死脱落等反应。连花清咳片由麻黄、石膏、连翘、桑白皮、黄芩等15味中药组成，具有清宣肺热、化痰止咳的功效，用于急性支气管炎的治疗。本研究采用卡他莫拉菌合并烟熏滴鼻复制大鼠急性支气管炎模型，评价连花清咳片对急性支气管炎的保护作用，并从抗氧化、抗炎和调节免疫等方面初步探讨其作用机制。

1、材料

1.1 动物

选取SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重182～220 g[湖南斯莱克景达生物技术有限公司]；湖南省药物安全评价研究中心屏障环境检疫饲养，在普通环境烟熏造模。

1.2 细菌

卡他莫拉菌（临床株）由湖南省药物安全评价中心鉴定、培养和扩增。

1.3 试药

连花清咳片（石家庄以岭药业股份有限公司，规格：1.843 g生药/片，批号：A1401001）。银黄清肺胶囊（湖南安邦制药有限公司，规格：0.15 g/粒，批号：181001），血琼脂基础（批号：20180511，青岛高科技工业园海博技术有限公司），无菌脱纤维羊血（批号：180915，广州鸿泉生物科技有限公司），旱烟烟草叶（自制），IL-6（批号：201811）、IL-8（批号：201811）、IL-10（批号：201811）、TNF-α（批号：201811）、NO（批号：201811）、SOD（批号：201811）、MDA（批号：201811)ELISA检测试剂盒（Bio-Swamp）。

2、方法

2.1 造模、分组与给药

大鼠急性支气管炎模型参照相关文献[4,5,6,7]制备并加以改良，具体方法如下：SD大鼠60只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，银黄清肺胶囊对照药组（0.18 g·kg-1），低、中、高剂量连花清咳片组（1.47、2.93和5.86 g生药·kg-1），每组10只动物。除正常对照组不做处理外，其余各组大鼠采用混合烟熏法复制大鼠急性支气管炎模型（每组用5 g烟叶与1 g锯末混合后点燃，待烟雾浓度平衡后，冲入大鼠染毒笼中，持续染毒30 min），每日1次，连续14 d。同时大鼠经鼻滴入卡他莫拉菌（3×109 CFU·m L-1)5滴/只，每周1次，连续2周。各给药组大鼠于造模同时，按10m L·kg-1灌胃给予相应药液，正常对照组和模型对照组分别灌胃给予等体积纯水。每日1次，连续14 d。

2.2 标本采集

末次给药后次日，各组大鼠腹腔注射20%的乌来糖水溶液（1000 mg·kg-1）麻醉，用1 mL生理盐水灌洗左侧肺叶，反复3次，收集肺泡灌洗液，取右侧支气管及肺组织，10%中性福尔马林固定，用于组织病理学检测。

2.3 指标检测

参照试剂盒说明书步骤ELISA检测肺泡灌洗液IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量；参照试剂盒说明书比色法检测肺泡灌洗液NO、SOD、MDA；采用流式细胞仪检测肺泡灌洗液中CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例，计算CD4+/CD8+。

2.4 组织病理学检查

取固定好的肺叶（附主支气管），行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，经HE染色、中性树胶封固后显微镜观察肺组织及支气管的病理改变。

2.5 统计学方法

数据结果以均数±标准差表示，组间比较采用SPSS 16.0进行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 大鼠一般状态观察

整个实验过程中，正常对照组大鼠饮食正常，活泼好动，呼吸均匀，被毛光泽，精神状态正常，体重自然增长。与正常对照组比，模型对照组大鼠不喜活动，呼吸频率加快，呼吸急促，后期部分大鼠腹式呼吸，被毛不光泽。与模型对照组比较，给予不同浓度连花清咳片或银黄清肺胶囊的各组大鼠，一般活动和呼吸状况明显改善。

3.2 炎症因子检测

如表1所示，与正常对照组比较，模型对照组动物肺泡灌洗液中的IL-6、IL-8、TNF-α的含量明显增加（P<0.01),IL-10含量明显减少（P<0.01）；与模型对照组比较，连花清咳片中、高剂量组肺泡灌洗液中IL-6的含量，低、中、高剂量组的IL-8含量，高剂量组的TNF-α含量均显著减少（P<0.05或P<0.01），中、高剂量组肺泡灌洗液中的IL-10含量显著增加（P<0.01）。与模型对照组比较，银黄清肺胶囊组大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8含量显著减少(P<0.05或P<0.01）。

表1连花清咳片对急性支气管大鼠肺泡灌洗液中炎症因子的影响

3.3 抗氧化能力检测

表2连花清咳片对急性支气管大鼠肺泡灌洗液中抗氧化能力的影响

如表2所示，与正常对照组比较，模型对照组动物肺泡灌洗液中的MDA的含量明显增加（P<0.01),SOD和NO含量明显减少（P<0.01）；与模型对照组比较，连花清咳片中、高剂量组肺泡灌洗液中SOD、NO含量显著增加（P<0.05或P<0.01),MDA含量显著减少（P<0.05）。与模型对照组比较，银黄清肺胶囊对照药组肺泡灌洗液SOD、NO含量显著增加（P<0.01）。

3.4 免疫功能影响

表3连花清咳片对急性支气管大鼠肺泡冲洗液中免疫细胞的影响

如表3所示，与正常对照组比较，模型对照组动物肺泡灌洗液中的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例降低，但无显著性差异，CD4+/CD8+细胞的比例显著降低（P<0.01）；与模型对照组比较，连花清咳片中、高剂量组肺泡灌洗液中淋巴细胞CD4+/CD3+比例显著上升（P<0.05或P<0.01），低、中剂量组CD8+/CD3+的比例显著增加（P<0.05或P<0.01），中、高剂量组肺泡灌洗液中CD4+/CD8+比例显著上升（P<0.01）。与模型对照组比较，银黄清肺胶囊对照药组肺泡灌洗液中淋巴细胞CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例以及CD4+/CD8+比值显著上升（P<0.05或P<0.01）。

3.5 肺组织及支气管病理学检查

图1连花清咳片对急性支气管炎模型大鼠支气管及肺脏组织病理改病的影响（HE染色，×200)

如图1所示，正常对照组送检动物支气管黏膜上皮完整，黏膜下未见充血、水肿及炎症细胞浸润，支气管周围肺泡结构正常，间质未见炎症细胞浸润，肺泡腔内未见明显的渗出物。与正常组比较，模型对照组支气管上皮细胞变性、坏死，腔内见较多脓性分泌物。病变支气管周围肺泡结构不清，有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。部分病变实变区融合。实变区周围部分肺泡壁增厚，其内血管扩张，间质有部分炎症细胞浸润。少数动物病情严重，出现广泛性肺出血和脓肿形成。与模型对照组比较，连花清咳片中、高剂量组和银黄清肺胶囊对照药组动物支气管及肺脏病理改变均有明显改善，支气管及肺组织基本正常，仅见少量炎症细胞浸润。

4、讨论

本研究在文献[4,5,6,7]报道的造模方法基础上加以改良，采用卡他莫拉菌合并烟熏（5 g烟叶与1 g锯末混合后点燃）复制大鼠急性支气管炎模型。卡他莫拉菌合并吸烟大鼠出现呼吸急促，呼吸声加大、咳嗽等症状，支气管及肺组织HE染色显示，模型对照组支气管上皮细胞变性、坏死，腔内见较多脓性分泌物。病变支气管周围肺泡结构不清，有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，说明大鼠急性支气管炎模型复制成功。银黄清肺胶囊有清肺化痰、止咳平喘的作用，用于慢性支气管炎急性发作之痰热壅肺证，故选择其作为阳性对照药。

Th1、Th2细胞释放的多种细胞因子和炎性介质参与了气道炎症[8]的形成。IL-8能在气道内聚集、活化中性粒细胞，诱导其脱颗粒并释放溶酶体酶，参与调控炎症反应[9,10]。IL-6在急性炎症的过程中参与反应蛋白的合成，是气道炎症反应过程中的重要因子[11,12],IL-10能抑制Th1细胞株细胞因子m RNA的转录。张磊等[13]认为IL-10可以抑制所有促炎因子的合成。TNF-α是机体在受到病毒、细菌等因素作用后，产生最快、达到高峰时间最短的炎症介质[14]。本实验中连花清咳片中、高剂量组肺脏中细胞炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的表达减少，抑炎症因子IL-10的表达显著增加，提示连花清咳片能显著抑制大鼠支气管炎模型肺脏和支气管中炎症反应，有效控制大鼠急性支气管炎发病过程。

NO是由气道和肺的上皮、肺血管内皮细胞以及炎症细胞包括肺泡巨噬细胞等合成和释放的生物活性因子，反映肺组织血管、肺泡壁受损程度。SOD是肺组织的主要抗氧化剂，它分布于细胞表面及胞外基质中，对于保护肺泡细胞及抑制基质的过度重建有重要作用[15],MDA是氧化反应的产物，是反映机体氧化损伤程度的经典指标之一。本实验中连花清咳片中、高剂量组肺脏中脂质过氧化物MDA的产生减少，抗氧化酶NO、SOD的含量增加，提示连花清咳片能通过减少肺脏中MDA含量来抑制氧化应激反应，并通过增加SOD、NO的含量来增强其抗氧化能力。

CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例反映机体免疫功能，当机体免疫力低下，细胞免疫功能受抑制时，CD4+/CD3+、CD8+/CD3+细胞的比例降低，CD4+/CD8+细胞的比值降低。与模型对照组比较，连花清咳片中、高剂量组CD4+/CD8+细胞的比值明显升高，这表明连花清咳片能通过改变肺脏中免疫细胞的比例来缓解免疫功能紊乱，增强免疫力。

同时，连花清咳片中、高剂量组能减轻支气管黏膜上皮变性、坏死和炎症细胞浸润。表明连花清咳片可以改善急性支气管炎大鼠支气管与肺组织的病理变化，具有缓解支气管炎症的作用。

综上所述，连花清咳片对细菌合并烟熏所致的大鼠急性支气管炎具有显著的保护作用，其机制与降低肺脏组织中炎性因子，抗氧化和提高细胞免疫功能有关。

参考文献：

[1]韩磊,强选平,费娟子.肺必清汤对急性支气管炎大鼠血清IL-2､IL-8水平影响研究[J].陕西中医药大学学报,2016,39(1):97-98,111.

[2]袁颖,高静琰,薛明明,等.疏风解毒胶囊对于急性支气管炎大鼠模型的保护作用[J].中华中医药杂志,2017,32(1):278-281.

[3]阮斌,胡还甫,余林岚.清宣止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的影响[J].首都医药,2010,17(6):43-44.

[4]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,2010.

[5]彭成.中医药动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2008.

[6]李敏,魏朝霞.小儿清肺止咳口服液对烟雾诱发的急性支气管炎大鼠的血清IL-4及IFN-γ水平的影响[J].中国妇幼健康研究,2017,28(5):524-525,546.

[7]各廷秋.急性支气管炎中医证候分布规律及急支方对急支模型大鼠的机理研究[D].合肥:安徽中医药大学,2017.

[9]叶胜兰,李承红.COPD急性发作期患者血清IL-2/IL-8/CRP水平变化及与肺功能的相关性分析[J].内科急危重症杂志,2010,16(1):34-36.

[10]王爱华,李全新.IL-2､IL-4､IL-6和IL-8在慢性阻塞性肺部疾病发病中作用的初探[J].江西医药,2000,35(2):72-73.