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滇白珠的化学成分、药理活性及质量控制研究

2023-10-07 113 上传者：管理员

摘要：应用有机化学分析方法，以HPLC为分析工具，对滇白珠的主要化学成分进行初步分析，提取有效化学成分；而后通过药理活性实验，对滇白珠的药理活性进行测试，结果显示，滇白珠地上部分对J774巨噬细胞株的抑制作用最为突出，其主要源于水杨酸甲酯糖苷类化合物、滇白珠素A和滇白珠素B的作用。在此基础上，结合当前滇白珠变种较多易混淆的现状，从多个角度入手提出质量控制方面的相关建议，以期为今后的滇白珠研究与应用提供参考。

关键词：
传统民族药材
化学成分
滇白珠
药理活性
质量控制
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滇白珠是一种典型的传统民族药材，又称为“透骨草、黑油果、登能”等，属于杜鹃花科白珠树属植物，其始载于明初的《滇南本草》一书中。其全草均有药用价值，具有祛风除湿、清热解毒、活血化瘀和顺气平喘等多种功效。随着现代医学技术的进步，对滇白珠做了进一步分离与研究，目前已从中分离出83种化学成分，包括水杨酸甲酯糖苷类、黄酮类、木脂素类、挥发油类以及有机酸类等。现代药理学研究证明，滇白珠中的有效化学成分，在抗炎、镇痛、抗氧化、止泻等方面的药理活性较为突出，同时滇白珠的特殊香型也使其在香料工业中得到普遍应用，受到了广泛的关注与研究。本次研究将在已有文献资料基础上，进一步探寻其化学成分、药理作用和质量控制策略，从而为其进一步研究和开发利用提供科学依据[1]。

1、实验部分

1.1材料与仪器

滇白珠药材样品，采集自云南某地，经有关专家鉴定后，确认其为滇白珠；乙醇、乙腈、甲酸、磷酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；去离子水，实验室自制。

KQ-500E型超声波清洗器，昆山超声仪器公司；DS型电热三用水浴锅，北京医疗设备厂；PL303型电子分析天平，梅特勒-托利多；Agilent-1200高效液相色谱仪，美国安捷伦。

1.2滇白珠化学成分分析

使用粉碎机将滇白珠药材样品打碎为粉末，过20目筛，精密称取1.0 g，加入50%乙醇水溶液20 mL；室温下超声波清洗器提供超声环境，对液相进行60 min处理、摇匀。将混匀后的混合液过0.22μm滤膜，即得样品溶液，而后选取少量样品溶液进行HPLC分析。

采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱进行分析，流动相组成：0.5%乙酸水溶液和乙腈混合物，梯度洗脱条件：0～12min,10%B;12～25 min,10%～20%B;25～40 min,20%B;40～50 min,20%～60%B;50～55 min,60%～75%B，流速：1.0 mL/min，进样量：10μL，检测波长经全波长扫描后确定为290 nm。

1.3滇白珠药理活性分析

根据文献[2]可知，在滇白珠中，水杨酸甲酯糖苷类化合物（对应2.1中所分离得到的“化合物4”）在抗炎镇痛活性上的表现相对较为优异，且其化学结构与阿司匹林相似，因此研究界通常认为，该物质是滇白珠的药效物质基础，其作用机制主要与抑制炎症介质的产生和分泌、自由基的产生及细胞因子的产生有关[3]。同时，也有研究指出，巨噬细胞系统的活性直接决定着炎症反应的程度，当巨噬细胞系统活性过高时，其处于“亢奋状态”，必须引入相关药物发挥拮抗作用，才能使得炎症得到明显抑制[4,5]。基于此，在本环节的研究中，为实现滇白珠药理活性优势的最大化，以滇白珠的不同部位为变量，并以J774小鼠巨噬细胞为研究对象，研究不同部位滇白珠在抗炎镇痛活性上的差异。

1.4试验用细胞培养方法

在本次实验中，主要选用P7级别的J774巨噬细胞，将90%以上汇合的细胞加入2 mL PBS液体进行清洗，再加入2 mL胰酶进行消化处理。待细胞完全脱离瓶壁而分散后，加2 mL培养液混匀，离心后除去上清液，再加4 mL培养液，将其吹打均匀，分瓶，每瓶1 mL。然后每瓶再加6 mL培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

2、结果与讨论

2.1滇白珠主要化学成分鉴定

经过反复分离、纯化和洗脱后，共获得7种化合物，编号为1～7。使用核磁共振氢谱、红外光谱等对其进行综合鉴定，同时文献对波谱数据进行对比分析[6,7]，得到鉴定结果如下：化合物1为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，其在甲醇环境下为黄色结晶状物；化合物2为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，其在甲醇环境下为黄色结晶状物；化合物3为龙胆酸甲酯，其在甲醇环境下为白色结晶；化合物4为水杨酸甲酯糖苷类化合物，其在甲醇环境下为白色结晶体；化合物5为白珠苷类化合物，其在室温环境下为无定型白色粉末状物；化合物6为滇白珠素A，其在室温环境下为无定型白色粉末状物；化合物7为滇白珠素B，其在室温环境下为无定型白色粉末状物[1,2]。

2.2实验参数优化

考虑到滇白珠中多种化学成分均不易溶于水，需要使用DMSO（二甲基亚砜）溶解，而过高浓度的DMSO又容易给细胞带来额外的毒害作用，进而影响实验准确性。因此在实验中，研究人员选定对细胞无毒的DMSO浓度进行测试。

选用生长情况较为良好的J774巨噬细胞，经胰酶消化后，使用10%胎牛血清悬浮液进行调整，确保细胞数为150个/μL。加至96孔细胞培养板中，在37℃、5%CO2的环境下培养24 h，至细胞长成单层后移除培养液，并使用培养液将DMSO分别稀释为5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%和0.05%。分别等量加入各个细胞孔，在37℃、5%CO2环境下培养24 h，而后在酶联免疫监测仪上测定各个孔吸光度，结果见图1（图中系列1为对照组，使用去离子水作为空白对照）。

图1不同浓度DMSO对细胞的毒性影响

由图1可知，当DMSO浓度低于0.2%时，未对细胞造成明显毒性影响，因此确定DMSO浓度为0.2%。

2.3滇白珠不同部位对J774细胞增殖的影响

在细胞培养完成后，取适量生长较好的J774巨噬细胞，经胰酶消化后，使用10%胎牛血清悬浮液进行调整，确保细胞数为100个/μL，加至96孔细胞培养板中。分别取滇白珠地下部位、地上部位和全株，分别使用70%乙醇溶液提取浸膏，加入DMSO配制不同浓度的含药溶液，振荡均匀后放置于培养J774巨噬细胞的孔板中，考察滇白珠不同部位对J774巨噬细胞株增值的影响，实验结果见表1。

表1滇白珠不同部位对J774巨噬细胞株增值影响分析

在该表数据基础上，应用SPSS软件对原始数据进行处理分析，求得滇白珠地下、地上和全株的IC50值（该值用以描述巨噬细胞增值被抑制50%时的抑制药物浓度）分别为35.73,28.00,43.27μg/m L。

根据表1中的数据可知，在滇白珠的不同药用部位，地上部分对J774巨噬细胞株的抑制作用最为突出，因此在后续研究中，应当优先考虑应用滇白珠地上部分。

针对滇白珠最具药理活性的地上部分，分别使用不同方式进行萃取，并对不同萃取物的IC50值进行统计分析，结果见表2。

表2不同萃取方法下滇白珠地上提取物的IC50值

从表2可见，在使用乙醇进行萃取时，其对于J774细胞的抑制作用最为突出，而使用正丁醇和水进行萃取后，对J774巨噬细胞几乎没有产生影响，因此使用乙醇进行萃取。

2.4滇白珠有效成分的确定

在此基础上，为进一步结合已有参考文献印证滇白珠中最具药理活性的有效成分，应用本次提取出的7种化学成分，均使用无水乙醇进行溶解，对其IC50值进行测定和对比分析，分析结果如下表所示。

表3滇白珠中不同化学成分的IC50值

从表3可见，在滇白珠的几种主要化学成分中，化合物4（即水杨酸甲酯糖苷类化合物）药理活性相对最为突出，成为后续研究中重点提取成分。其次，化合物6和化合物7（对应滇白珠素A和滇白珠素B）也具有一定的药理活性，而其他化合物的药理活性则不突出。

3、结论

结合既有研究，通过液相色谱法从滇白珠原材料中提取出7种主要化学成分，表明滇白珠植株内的化学成分种类相对较为丰富。在此基础上，以小鼠J774巨噬细胞作为研究对象，对滇白珠植株内化学成分的药理活性进行了研究，通过对滇白珠植株不同部位、不同萃取方式的调整，以及对不同化学成分的药理活性进行分析可知，采用乙醇对滇白珠地上部分进行萃取，优先提取水杨酸甲酯糖苷类化合物成分最为有效。

从目前实际情况来看，滇白珠的近缘种和变种较多，经常在同一地域内存在着诸如芳香白珠、尾叶白珠、红粉白珠等多个近缘种和变种。这些近缘种和变种在外观上与滇白珠高度相似，但在有效活性成分上则相去甚远。以往也出现将这些近缘种和变种误认为是滇白珠，而导致实际药效不尽如人意的情况。为避免此类问题发生，在今后的工作中，建议基于以下方面对滇白珠进行质量控制：

1）对易混淆的植株进行有效分类。采用化学计量学方法进行有效分类是一个切实可行的举措。基于该方法与液相色谱技术进行联合应用，对主要成分进行相似度分析和聚类分析，明确不同植株在主要成分上的差异，即可有效分离出滇白珠，避免再次出现以往的错误[6,7]。

2）滇白珠的加工过程中，要对加工方法进行优化。滇白珠中的水杨酸甲酯糖苷等具有药理活性的化学物质容易在高温和强光照射下挥发，导致其有效含量的降低。在加工处理滇白珠原材料时，建议优先采用超声波萃取等方式进行，避免使用有机溶剂萃取+晾晒的传统模式，以确保滇白珠加工成品后仍具有较高的有效成分含量。

3）对实际取用的滇白珠植株部分进行优选。建议在后续的滇白珠加工环节中，优先选择滇白珠的地上部分入药，以提升其药理活性。

参考文献:

[1]威则日沙.基于多指标综合分析的彝药材臭节草和滇白珠质量研究[D1.成都:西南民族大学2021

[2]李依容.民族药滇白珠的谱系地理学研究[D].昆明:昆明医科大学,2020

[3]胡耶芳,李晓,刘子祯,等滇白珠的化学成分､药理活性及质量控制研究进展[J].中成药,2020,2(1):162-168

[4]李院王秀环,赵怡程等.HPLC测定民族药白珠抗炎镇痛活性部位(ARF)中4种活性成分的含量J.中国实验方剂学杂志,2019.25(24):91-96

[5]赵怡程,何婷,翁稚颖,等一种滇白珠富含水杨酸甲酷糖昔抗炎镇痛活性部位提取富集方法的探索IJ.国际药学研究杂志,2017,44(9):884-889

[6]肖壮,朱成华,唐涛.滇白珠的药理､毒副作用研究及开发应用进展[J1中国药房,2017,28(26):3726-3729

[7]何婷,赵怡程,李鹏跃,等.滇白珠抗炎镇痛活性部位的化学成分研究IJ中草药2017,48(17):3469-3474.

文章来源:江明明,薛金林,周菊.滇白珠的化学成分､药理活性及质量控制研究[J].日用化学品科学,2023,46(09):62-65.