胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是一种预后不良且死亡率高的恶性肿瘤[1].2020年，全球胰腺癌发病率为6.4/105,死亡率为6.0/105,在所有恶性肿瘤中分别排名第12位和第7位[1].在过去20年中，吉西他滨一直被认为是治疗胰腺癌的标准药物，并被广泛用作晚期胰腺癌的一线药物[2].与5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，吉西他滨的临床疗效反应是5-FU的5倍(23.8% vs. 4.8%)[2].近年来，FOLFIRINOX和吉西他滨联合白蛋白结合型紫杉醇在胰腺癌患者中显示出更好的临床疗效，但同时也导致了更多不良反应，限制了这两种联合方案的临床应用[3-4].尽管吉西他滨和其他治疗药物对晚期和转移性胰腺癌患者有效，但吉西他滨化疗耐药性的发展严重限制了这种化疗的有效性[5].如何克服吉西他滨在胰腺癌中的化疗耐药性仍然是胰腺癌治疗的挑战之一.

microRNA(miRNA)是含有约22个核苷酸的短非编码RNA,可与其靶标mRNA的3′-UTR结合，并抑制这些蛋白的产生以调节基因表达[6].在各种类型的癌症中，miRNA与化疗耐药性密切相关[7].在胰腺癌中，miR-21通过抑制PTEN来促进吉西他滨化疗耐药性，从而激活PI3K/AKT通路[8].Wang等指出miR-30a通过靶向Snail-AKT信号转导通路逆转胰腺癌中的吉西他滨耐药过程[9].Gu等发现miR-3178通过激活PI3K/AKT通路介导的ABC转运蛋白上调来促进胰腺癌对吉西他滨的耐药性[10].据报道，miR-483-3p失调与肿瘤耐药性密切相关[11-14].然而，miR-483-3p在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用未见报道.

本研究采用体外药物浓度递增法建立吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR,并在倒置显微镜下观察细胞形态；用MTT法和qPCR实验评估耐药细胞生物学特性的改变；用qPCR实验检测miR-483-3p在耐药细胞系SW1990-GR中的表达变化；用MTT法、划痕实验和Transwell实验探究miR-483-3p对耐药细胞增殖、迁移、转移和侵袭的作用；用Western blot实验研究miR-483-3p对PI3K/AKT信号通路以及凋亡相关蛋白表达水平的影响.

1、实 验

1.1材料与试剂

人胰腺癌细胞系SW1990购自美国ATCC公司.MTT(M8180)、PMSF(100 mmol/L,P0100)、蛋白酶抑制剂(A8260)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)、脱脂奶粉(LP0033B)和青链霉素混合液(100×,P1400)购自北京索莱宝科技有限公司.RIPA(P0013B)和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1,C2006)购自上海碧云天生物.DMEM培养基(8121713)和胎牛血清(FBS,1715753)购自美国Gibco公司.盐酸吉西他滨(G120180,50 mg)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.β-actin(66009-1-lg)抗体购自Proteintech公司.AKT(ab8805)抗体、p-AKT(Thr308,ab131474)抗体、Bax(ab32503)抗体、Bad(ab32455)抗体、Caspase-3(ab32351)抗体和Bcl2(ab32124)抗体购自Abcam公司.PI3K(T40115)抗体购自Abmart公司.鼠二抗(A25012)和羊二抗(A25022)购自Macklin公司.miR-483-3p minics和minics NC由上海生工生物合成.研究所用到的qPCR引物均由北京擎科生物合成.

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

细胞系SW1990、SW1990-GR使用含10%FBS和1%青链霉素混合液的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养.

1.2.2吉西他滨耐药细胞建立

按照文献描述的方法建立吉西他滨耐药细胞系[15].SW1990细胞用吉西他滨处理48 h,药物浓度按0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μmol/L逐步增加.在每个剂量诱导完成后，丢弃凋亡细胞并在无吉西他滨培养基中继续培养存活的细胞，此步骤重复3次.然后将细胞暴露于下一个浓度增加的吉西他滨中，直到细胞在有吉西他滨的培养基中正常生长，最终获得吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR.

1.2.3 MTT法

取对数生长期的SW1990或SW1990-GR细胞消化后，按照每孔3×103～5×103个细胞接种于96孔板中.第二天加入一系列浓度的吉西他滨(0、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、25、50μmol/L),每组设置6个重复，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养72 h.每孔加入10μL 5.5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h后吸去上清液，每孔加入150μL DMSO振荡10 min,使紫色结晶充分溶解.用酶标仪(TECAN,Infinite 200 PRO)检测490 nm波长处的吸光度.使用GraphPad Prism 8.0.1统计分析软件计算IC50.

1.2.4细胞转染

取对数生长期的SW1990-GR细胞消化后接种于6 cm培养皿中，第二天细胞汇合度达到50%～60%,将miR-483-3p minics或minics NC与转染试剂Lip2000形成的复合物加到培养皿中，轻摇混合均匀.继续培养24～48 h,收集细胞用于后续实验.

1.2.5 RNA提取

收集细胞于1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol混合均匀，使细胞裂解完全；再加入200 mL氯仿，振荡10 s混合均匀，室温静置5 min, 4℃、12 000 r/min离心15 min;取上层水相于新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇室温沉淀10 min, 4℃、12 000 r/min离心15 min;去掉上清液，加入1 mL 75%乙醇，轻轻吹打，4℃、12 000 r/min离心10 min;去掉上清液，室温干燥5 min,加入适量无菌无酶水充分溶解RNA.用NanoDrop微量分光光度计(Thermo Scientific)测量RNA样品浓度后，于-80℃保存.

1.2.6 qPCR实验

按照Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)说明书配制反转录反应液，设置反应程序：37℃、15 min, 85℃、5 s, 4℃.反转录结束后按照MonAmpTMUniversal ChemoHS Specificity Plus qPCR Mix(MQ00801)说明书配制qPCR反应液，在Roche LightCycler 480仪器上设置反应条件.预变性：95℃、10 min, 1个循环.PCR反应：95℃、10 s, 60℃、30 s,共40个循环.熔解曲线：95℃、15 s, 60℃、60 s, 95℃、15 s, 1个循环.hsa-miR-483-3p逆转录引物为5′-GTCGTATC-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-ATACGACAAGACG-3′,前引物为5′-CGCGTCACTCCTCTCCTCC-3′,后引物为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′.U6前引物为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,后引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′.

1.2.7 Western blot实验

收集细胞于1.5 mL离心管中，加入RIPA裂解液、PMSF(1%)和蛋白酶抑制剂(1%)混合均匀，于冰上裂解15 min.4℃、12 000 r/min离心15 min,取上清液.用BCA蛋白浓度测定试剂盒鉴定样品总蛋白浓度.按照比例加入5×上样缓冲液于95℃金属浴中煮15 min,蛋白样品于-20℃保存.配制10%～15% SDS-PAGE分离胶，每孔加入20μg蛋白样品，浓缩胶电泳分离条件为80 V、30 min,分离胶电泳分离条件为120 V、120 min.电泳完成后，将目标条带转移至甲醇激活的PVDF膜上，转膜条件为冰浴、300 mA和30～90 min.转膜结束后，将PVDF膜放于5%脱脂奶粉中封闭2 h,用TBST清洗膜3次，每次10 min.加入一抗(体积比1∶1 000)于4℃过夜孵育.第二天，用TBST清洗膜3次，每次10 min,加入二抗(体积比1∶5 000)于室温孵育1～2 h.用TBST清洗膜3次，每次10 min,加入ECL超敏发光液避光孵育3～5 min,用凝胶成像仪(Bio-Rad, 17001402,ChemiDOC MP Imaging System)进行显影.

1.2.8划痕实验

将转染miR-483-3p minics或minics NC的SW1990-GR细胞消化后接种于6孔板中，第二天细胞汇合度为50%～60%.用200μL吸头沿着直尺均匀用力划线，用PBS洗去掉落的细胞.用倒置显微镜(Olympus, U-RFL-T)分别在0 h和48 h拍照.

1.2.9 Transwell实验

将转染miR-483-3p minics或minics NC 24 h的SW1990-GR细胞消化后计数，接种2×105个细胞于Transwell小室(Corning Costar公司),加入200μL不含FBS的DMEM培养基，将小室放于24孔板中，下室加入600μL含10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h.用棉签轻轻拭去上室未穿过的细胞，4%多聚甲醛固定15 min,再用1%结晶紫溶液染色15 min,用清水洗去多余的结晶紫溶液，干燥后于倒置显微镜下进行拍照.

1.2.10 JC-1检测细胞凋亡

取对数生长期的SW1990-GR细胞消化后接种于6孔板中，第二天细胞汇合度为50%～60%时，转染miR-483-3p minics或minics NC,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h.按照碧云天JC-1试剂盒(C2006)说明书进行染色，于荧光倒置显微镜下进行拍照.

1.2.11数据分析

使用GraphPad Prism 8.0.1统计分析软件和ImageJ图像分析软件对实验数据进行分析.使用t检验或单因素方差分析进行统计分析.*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001显示统计显著性.

2、结果与讨论

2.1吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR

为了建立吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR,将SW1990细胞暴露于增加浓度的吉西他滨中10个月，以获得稳定的吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR.如图1(a)所示，用MTT法检测SW1990和SW1990-GR细胞的存活率并计算IC50,与SW1990相比，SW1990-GR对吉西他滨的IC50从0.090 54μmol/L上升至23.83μmol/L,耐药指数为263.2.

肿瘤耐药性的产生通常伴随着细胞形态和生物学特性的改变[16].如图1(b)所示，与SW1990细胞相比，SW1990-GR细胞形态呈现梭形变化，并越来越多地表现出间充质表型.

ATP结合盒(ABC)转运蛋白与肿瘤化疗耐药性密切相关，其在实体瘤中显著高表达[17].使用qPCR检测两种ABC蛋白ABCG2和ABCC1 mRNA表达水平，如图1(c)所示，与SW1990相比，SW1990-GR中ABCG2和ABCC1 mRNA显著高表达.

为了进一步探究耐药细胞生物学特性改变，用MTT法检测了SW1990和SW1990-GR细胞在0、24、48、72 h的细胞存活率，绘制了生长曲线，如图1(d)所示，SW1990-GR细胞增殖能力显著弱于SW1990细胞.总之，吉西他滨耐药细胞系SW1990-GR成功建立.

2.2 miR-483-3p增强胰腺癌对吉西他滨敏感性

利用qPCR实验检测了吉西他滨耐药细胞和亲本细胞中miR-483-3p的表达水平，如图2(a)所示，相对于SW1990细胞，miR-483-3p在SW1990-GR细胞中的表达降低了90%左右.

为了探究miR-483-3p是否与胰腺癌吉西他滨耐药有关，将50 nmol/L miR-483-3p minics或minics NC瞬时转染到SW1990-GR细胞中来调节细胞内miR-483-3p表达水平，转染24 h后提取RNA,用qPCR实验检测miR-483-3p表达水平.如图2(b)所示，相对于minics NC组，minics组SW1990-GR细胞内miR-483-3p的表达水平显著提高了约10倍.

图1亲本细胞与吉西他滨耐药细胞的形态以及 生物学特性

随后分别用浓度为0、5、10、25、50μmol/L的吉西他滨作用于SW1990-GR细胞，用MTT法检测细胞存活率并计算IC50,如图2(c)所示，miR-483-3p能显著降低SW1990-GR细胞对吉西他滨的IC50.

图2 miR-483-3p增强SW1990-GR细胞对 吉西他滨敏感性

为了进一步确定miR-483-3p是否会影响吉西他滨耐药细胞的增殖，用MTT法检测转染miR-483-3p minics或minics NC后SW1990-GR细胞在0、24、48、72 h的细胞存活率，绘制了生长曲线，如图2(d)所示，miR-483-3p能显著抑制SW1990-GR细胞的增殖.

通过Transwell实验来检测miR-483-3p对SW1990-GR细胞侵袭和转移的影响.如图3(a)、(c)所示，miR-483-3p能显著抑制SW1990-GR细胞侵袭和转移能力.通过细胞划痕实验来检测miR-483-3p对SW1990-GR细胞迁移的作用，如图3(b)、(c)所示，miR-483-3p能显著抑制SW1990-GR细胞迁移能力.

图3 miR-483-3p抑制SW1990-GR细胞侵袭、转移和迁移

综上所述，miR-483-3p通过抑制耐药细胞增殖、迁移、转移和侵袭能力来增强SW1990-GR细胞对吉西他滨的敏感性.

2.3 miR-483-3p抑制PI3K/AKT信号通路

据报道，PI3K/AKT信号通路过度激活在胰腺癌吉西他滨耐药过程中起到重要作用[18].为了探究miR-483-3p能否影响PI3K/AKT信号通路，将50 nmol/L miR-483-3p minics或minics NC瞬时转染至SW1990-GR细胞中，48 h后提取细胞总蛋白.如图4(a)所示，Western blot结果证明miR-483-3p minics能够抑制PI3K和p-AKT蛋白表达水平，抑制PI3K/AKT信号通路.

图4 miR-483-3p抑制SW1990-GR细胞中PI3K/AKT信号通路

此外，如图4(b)所示，Western blot结果显示miR-483-3p minics抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表达，促进凋亡蛋白Bax、Bad和cleaved-Caspase-3的表达，促进SW1990-GR细胞凋亡.

为了进一步证实miR-483-3p的促凋亡作用，使用JC-1探针对转染miR-483-3p minics或minics NC的SW1990-GR细胞进行染色，用荧光倒置显微镜观察荧光强度，如图4(c)所示.miR-483-3p minics能显著促进SW1990-GR细胞的凋亡过程，如图4(d)所示.因此，miR-483-3p能通过抑制PI3K/AKT信号通路促进细胞凋亡，增强胰腺癌对吉西他滨敏感性.

3、结 语

据报道，miR-483-3p参与细胞凋亡[19]、EMT[12]、肿瘤化疗耐药[11]和葡萄糖代谢[13]等过程.miR-483-3p在某些肿瘤中显著上调[20-21],而在其他肿瘤中显著下调[22-23].在乳腺癌中，miR-483-3p可以靶向CCNE1或HDAC8以发挥抑癌作用[24-25].在食管鳞状细胞癌中，miR-483-3p已被证明高表达，并且miR-483-3p可通过调节细胞周期来促进ESCC细胞的增殖和迁移，从而增加细胞耐药性[24-25].miR-483-3p参与肿瘤化疗耐药已被广泛报道.miR-483-3p通过靶向人结直肠癌细胞中的FAM171B来调节奥沙利铂耐药性[11],并直接靶向整合素β3抑制下游FAK/Erk信号转导通路，从而促进EGFR突变型非小细胞肺癌中的吉非替尼获得性耐药[12].此外，miR-483-3p在THP-1-Aza细胞中显著降低，miR-483-3p的过表达会影响THP-1-Aza细胞对阿扎胞苷的敏感性[26].所有这些证据表明，miR-483-3p可能具有复杂的癌症类型特异性功能.在胰腺癌患者中，观察到miR-483-3p的异常表达是胰腺癌肿瘤发生的早期事件[27].此外，据报道，与慢性胰腺炎相比，miR-483在胰腺癌中的表达较低，而与正常胰腺相比，miR-483在相对慢性胰腺炎中表达较高[28].然而，miR-483-3p是否参与胰腺癌吉西他滨耐药尚未阐明.

与胰腺癌亲本细胞相比，miR-483-3p在吉西他滨耐药细胞中显著低表达.体外转染miR-483-3p minics能显著提高吉西他滨耐药细胞中miR-483-3p的表达水平，显著提高耐药细胞对吉西他滨的敏感性，并且抑制耐药细胞的增殖、迁移、转移和侵袭.此外，研究结果表明，miR-483-3p可以通过抑制PI3K/AKT信号通路促进细胞凋亡，这一发现与之前的报道一致，即miR-483-3p由于其促凋亡特性而对鳞状细胞癌具有抑制功能[19].

上述结果表明，miR-483-3p在胰腺癌吉西他滨耐药过程中起到重要作用，可能成为胰腺癌临床治疗新的靶点.当然，miR-483-3p在胰腺癌吉西他滨耐药过程的作用机制研究仍然处于探索阶段，需要进一步的实验验证.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81770846);

文章来源:刘青,肖桂山.miR-483-3p增强胰腺癌对吉西他滨敏感性及分子机制研究[J].大连理工大学学报,2025,65(01):30-37.