胰腺癌是一种具有高度侵袭性和转移能力的恶性肿瘤,近年来其发病率和死亡率逐渐上升[1]。 由于胰腺癌的早期症状不明显,患者多在晚期被诊断,因此其5年生存率仅为5% ~ 10%[2-3]。 大量研究表明,胰腺癌患者的转移率极高,大部分患者在确诊时已出现转移,主要转移部位包括肝脏、腹膜和淋巴结[4]。 这种高转移率是导致胰腺癌高死亡率的重要原因之一[5]。 肿瘤微环境是肿瘤细胞与周围细胞、基质和血管之间相互作用的产物,在胰腺癌的发展中发挥重要作用[6]。 最近越来越多的研究发现,胰腺癌微环境通常存在低氧状态,这种条件不仅影响肿瘤细胞的生存和增长,还会改变其代谢,促进侵袭性和转移性[7]。 近期研究发现,骨髓瘤过表达基因(myeloma overexpressed gene,MYEOV)是一种在多发性骨髓瘤中过表达的基因,在多种肿瘤中的表达显著增加,与肿瘤细胞的生长、存活和转移密切相关[8],但其在胰腺癌中的具体作用及其与胰腺癌瘤体组织低氧微环境之间的关系尚待探究。 因此,本研究旨在揭示低氧微环境如何通过MYEOV影响胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及上皮—间质转化(EMT)的机制,期望为胰腺癌的治疗提供新的靶点和策略,改善患者的预后与生存率。

1、材料与方法

1. 1细胞系和试剂

本研究中使用的细胞系为Capan-2细胞,该细胞系来源于人胰腺腺癌组织,具有较强的增殖、迁移和侵袭能力。Capan-2细胞购自美国典藏细胞中心(ATCC,Cat. No. HTB-79)。 细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS,Gibco,Cat. No. 10099-141)、1%青霉素—链霉素(Gibco,Cat. No. 15140-122)和DMEM培养基(Gibco,Cat. No. 11965-092)中进行,培养条件为37℃、5% CO2和饱和湿度。在本研究中使用的主要试剂包括:低氧培养箱,采用Thermo Fisher Scientific的Thermo Forma 3130(Model 3130,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)维持低氧环境,氧浓度设置为1%。MYEOV靶向siRNA,合成并提供商为Sigma-Aldrich ( Cat.No. SASI_Hs01_00122318),用于MYEOV的敲除实验。qPCR试剂,使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Cat. No. 4309155)进行定量PCR。 使用的抗体包括:抗-Vimentin ( Abcam,Cat.No. ab92547)、抗-E-cadherin(Cell Signaling Technology,Cat. No. 3195)、抗-β-actin( Sigma-Aldrich,Cat.No. A5441),进行免疫印迹。

1. 2细胞分组与转染

1. 2. 1细胞分组。

为了探讨MYEOV在低氧微环境中对Capan-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响,本研究将Capan-2细胞分为以下2组:对照组(Capan-2-FL组),未转染MYEOV siRNA的Capan-2细胞;MYEOV敲 除 组( Capan-2-MYEOV-/ -FL组),转 染MYEOV靶 向siRNA的Capan-2细 胞,以 实 现MYEOV的敲除。 低氧微环境:在低氧条件下(氧浓度3%、9% )培 养 的Capan-2-FL和Capan-2-MYEOV-/ -FL细胞。 常氧状态:在常规培养条件下培养的Capan-2-FL和Capan-2-MYEOV-/ -FL细胞。

1. 2. 2细胞转染。

Capan-2细胞在对数生长期时进行转染。 具体步骤如下:(1)细胞准备。 在6孔板中以每孔5×105个细胞的密度接种Capan-2细胞,培养至70% ~ 80%融合。(2)转染试剂准备。根据制造商的说明书,使用Lipofectamine 3000转染试剂(Thermo Fisher Scientific,Cat. No. L3000001)进行转染。 每管中加入200μL Opti-MEM培养基(Gibco,Cat. No. 31985-070),并加入适量的MYEOV靶向siRNA(100nmol / L)。(3)转染过程。 在转染试剂中加入5μL的Lipofectamine 3000,轻轻混匀后,室温孵育5min。 最终将转染混合物加入细胞培养中,轻轻摇晃以确保均匀分布。 转染后将细胞放回37℃ 、5% CO2的培养箱中孵育24h。(4)筛选细胞。 转染后48h,使用抗生素(如G418,Thermo Fisher Scientific,Cat. No. 10131-035)进行筛选,以获得稳定表达或敲除MYEOV的细胞系。

1. 3实验方法

1. 3. 1 CCK-8法检测Capan-2细胞增殖能力。

在96孔板中,以每孔5×103个Capan-2细胞接种,分别设置Capan-2-FL和Capan-2-MYEOV-/ -FL组,培养至70% ~ 80%融合,确保细胞处于对数生长期。 在37℃ 、5% CO2的条件下培养细胞24h、48h和72h,分别在这些时间点检测细胞增殖情况。 在培养结束前的最后4h,向每孔中加入10μL CCK-8试剂(Dojindo,Cat. No. CK04 ),继 续 培 养4h。 使 用 酶 标 仪(BioTek,Synergy H1)在450nm波长下测定每孔的光密度(OD)值。

1. 3. 2 Transwell实验检测Capan-2细胞的迁移和侵袭能力。

在进行实验前,将Capan-2细胞在常氧或低氧条件下培养至对数生长期。 使用带有8μm孔径的Transwell小室(Corning,Cat. No. 3422),在上室中加入200μL培养基(不含FBS),而在下室中加入600μL含有10% FBS的培养基,以提供化学引导。 在上室中加入5×104个Capan-2细胞,分别设置Capan-2-FL和Capan-2-MYEOV-/ -FL组。 将小室放置于37℃ 、5% CO2环境中,培养24h。 培养结束后,使用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞,用PBS洗涤小室,固定下室的细胞,使用甲醇固定5min。用0. 1%的结晶紫染色液( Sigma-Aldrich,Cat. No.C6158)染色10min后,用PBS洗去多余染料。 用显微镜观察并计数迁移到下室的细胞数量。 对于侵袭实验,Transwell小室内预先涂上基质胶( Matrigel,BD Biosciences,Cat. No. 354234),其余步骤与迁移实验相同。

1. 3. 3 qPCR检测Capan-2细胞EMT激活能力。

使用TRIzol试剂( Thermo Fisher Scientific,Cat. No.15596026)提取Capan-2细胞的总RNA。 按照试剂说明书操作,收集细胞,加入TRIzol,经过充分裂解后,加入氯仿,离心分层,取上清液。 使用逆转录合成 试 剂( One Step RT-PCR Kit, Qiagen, Cat. No.210212)将提取的RNA转录为cDNA,反应体系按照说明书配置。 使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Cat. No. 4309155 )进行qPCR反应。 每个反应体系中加入10μL SYBR Green,1μL引物(VIM和E-cad的特异性引物),1μL cDNA模板和8μL无RNA酶水。qPCR条件为:初始变性95℃10min,接着进行40个循环(95℃15s,60℃1min)。 使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量,比较Capan-2-MYEOV-/ -FL和Capan-2-FL组中VIM和Ecad的表达水平。

1. 3. 4 MYEOV敲除对移植瘤体积的影响。

选择6 ~ 8周龄的BALB / c裸鼠,随机分为Capan-2-FL组和Capan-2-MYEOV-/ -FL组,每组6只。 将Capan-2-FL和Capan-2-MYEOV-/ -FL细胞(各5×106细胞)分别注射到小鼠的右侧腋下皮下。 每周测量肿瘤体积,使用公式:体积= (长 × 短2) / 2计算肿瘤体积。 实验持续4周后,处死小鼠,取出肿瘤组织进行后续分析。

1. 3. 5免疫组化检测E-cad和VIM表达。

将移植的肿瘤组织固定在4%多聚甲醛中,经过脱水后切割成4μm厚的切片,放置在带涂胶的载玻片上。 在微波炉中进行抗原修复,使用柠檬酸缓冲液( pH6. 0)加热15min。 用5%牛血清白蛋白(BSA)在室温下封闭1h,以减少非特异性结合。 分别加入抗E-cad ( 1∶200, Cell Signaling Technology, Cat. No.3195 )和 抗-Vimentin ( 1∶200, Abcam, Cat. No.ab92547),在4℃ 孵育过夜。 次日用PBS洗涤切片后,加入HRP标记的二抗(1∶1 000,Thermo FisherScientific,Cat. No. 31460),在室温下孵育1h。 使用DAB显色试剂(Vector Laboratories,Cat. No. SK-4100)进行显色,随后用PBS洗涤,脱水并封片。 使用显微镜观察并拍摄图像,分析E-cad和VIM在肿瘤组织中的表达水平。

1. 4统计学方法

作图及数据分析以GraphPadPrism9. 0统计软件为基础进行。 计量资料以均数 ±标准差(x±s)表示,比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析,进一步用t检验进行两两比较。P < 0. 05为差异有统计学意义。

2、结果

2. 1 MYEOV敲除对Capan-2细胞增殖的影响

在相同氧浓度下,MYEOV敲除后,Capan-2细胞增殖能力明显下降(见图1),迁移能力明显下降(见图2),侵袭能力明显下降(见图3)。 该部分研究说明,MYEOV促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和分化,在胰腺癌的发展中发挥作用

图1 MYEOV敲除后胰腺癌细胞系增殖能力下降

图2 MYEOV敲除后胰腺癌细胞系迁移能力下降

图3 MYEOV敲除后胰腺癌细胞系侵袭能力下降

2. 2低氧微环境MYEOV敲除对Capan-2细胞的影响

在低氧微环境下,Capan-2增殖、迁移和侵袭能力较常氧状态上升。 而当将MYEOV敲除后,低氧对于Capan-2-MYEOV-/ -增殖(见图4)、迁移(见图5)和侵袭(见图6)能力的影响较常氧状态下降。 本研究说明,低氧微环境促进了胰腺癌的发生发展,而低氧微环境通过MYEOV调控胰腺癌的进展。

图4低氧微环境下胰腺癌细胞系增殖能力上升

图5低氧微环境下胰腺癌细胞系迁移能力上升

图6低氧微环境下胰腺癌细胞系侵袭能力上升

2. 3 qPCR检测VIM、E-cad表达

qPCR检测发现,Capan-2-MYEOV-/ -FL组较Capan-2-FL组VIM、E-cad表达降低(见图7),该研究结果证明,敲除MYEOV后,EMT激活受抑制,从而降低胰腺癌的分化及转移。

图7 qPCR检测EMT激活水平

2. 4 MYEOV对胰腺癌肿瘤生长的影响

体内实验研究发现,Capan-2-MYEOV-/ -FL移植组瘤体体积较Capan-2-FL组减小,证明敲除MYEOV,可抑制胰腺癌肿瘤的生长(见图8)。

图8肿瘤体积测量

2. 5肿瘤组织中EMT水平在敲除MYEOV后的变化

免疫组化检测发现,在瘤体中肿瘤组织中的EMT水平在敲除MYEOV后激活程度下降(见图9)。

图9免疫组化检测EMT激活水平

3、讨论

3. 1低氧微环境对Capan-2细胞的影响

胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤,其高转移率和低生存率使其成为重大公共健康问题。 研究表明,肿瘤微环境中的低氧状态在胰腺癌的发生和发展中起着重要作用。 低氧微环境不仅促使癌细胞的增殖和存活,还通过促进细胞迁移和侵袭能力,加剧肿瘤的恶性程度[9]。

在本研究中,低氧微环境下Capan-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著提高,这一机制为胰腺癌细胞在低氧微环境中生存和扩散提供了生物学基础。在肿瘤的快速生长过程中,尤其是胰腺癌,由于肿瘤细胞的代谢活动增加,血管供给往往无法满足细胞的氧气需求,导致局部出现低氧状态。 肿瘤细胞适应性地通过多种机制响应低氧微环境,促进其存活和扩散。 胰腺癌细胞在低氧微环境中的增殖能力通常会增强,该现象部分归因于HIF-1α 的激活。HIF1α 在低氧微环境下稳定,并转录调控多种促进细胞增殖的基因,如VEGF、PDGF和Cyclin D1等。 这些基因的上调不仅促进了细胞的增殖,还有助于肿瘤的血管生成,可进一步改善肿瘤细胞的氧气和营养供应[10]。 此外,低氧可以刺激细胞内的信号转导通路,例如PI3K/ Akt通路[11-12]。 该通路的激活可以增强细胞的生存能力,抑制凋亡,从而提升肿瘤细胞在低氧微环境下的增殖能力。 本研究结果显示,胰腺癌细胞在低氧微环境下的增殖速率显著高于常氧状态,说明低氧微环境为肿瘤的生长提供了有利条件。低氧微环境不仅促进肿瘤细胞的增殖,还显著增强了其迁移和侵袭能力。EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要机制。 在低氧微环境中,EMT过程的激活通常伴随着E-cadherin的下调和Vimentin的上调。HIF-1α 不仅在细胞增殖和迁移中发挥作用,还通过调控与EMT相关的转录因子(如Snail、Slug和Twist)来促进EMT的发生[13]。 低氧微环境直接或间接激活这些转录因子,从而促进上皮细胞向间质细胞的转化,该过程不仅改变了细胞的形态,还使细胞获得了更强的迁移和侵袭能力。EMT激活后的细胞通常表现出更高的耐药性,增加了治疗的难度[14]。

3. 2 MYEOV对胰腺癌细胞增殖的影响

MYEOV是一个新近被发现的基因,最初是2000年由Janssen等[15]在骨髓瘤细胞中高表达而被识别。MYEOV基因位于人类染色体的特定位置,编码的蛋白质在多种生物过程中具有重要作用。

在本研究中,通过MYEOV的敲除,Capan-2细胞在相同氧浓度下的增殖、迁移和侵袭能力明显下降。 这一发现表明,MYEOV在胰腺癌细胞的生物学特性中扮演着重要角色。 近年来,MYEOV在多种癌症,尤其是胰腺癌中的作用逐渐受到关注。MYEOV作为一个调控基因,参与细胞增殖、分化和凋亡等多个生物过程。 研究表明,MYEOV能够通过调节转录因子和信号转导通路影响下游基因的表达。 例如,MYEOV的上调被证实与非小细胞肺癌的不良预后相关,MYEOV ceRNA在非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移中起关键作用,发挥其促转移功能。MYEOV ceRNA独立于其蛋白质编码能力,但以miR-30c-2-3p结合依赖性方式存在,抑制miR30c-2-3p与其靶标TGFBR2和USP15 mRNA的结合,反过来又导致TGF-β 信号传导的激活和肿瘤进展[16]。 在胰腺癌方面,已经有研究表明MYEOV过表达可显著缩短胰腺癌患者的疾病特异性生存期[17]。MYEOV介导PDAC细胞中基因表达谱的整体改变。 通过miRNA-seq分析显示,MYEOV调节miR-17-5p和miR-93-5p的表达水平,其耗竭导致细胞增殖、侵袭和迁移减少[18]。Chen等[19]的研究中报道,qRT-PCR结果显示,相对于正常人胰腺导管上皮细胞,胰腺癌细胞中MYEOV mRNA的转录水平显著升高,它可以通过对hsa-miR-103a-3p和hsamiR-107产生分子海绵效应来充当ceRNA,从而影响GPRC5A、SERPINB5、EGFR、KRAS、EIF4G2和PDCD4对胰腺癌进展的作用。

此外,本研究结果还显示,MYEOV的敲除导致Capan-2细胞的迁移和侵袭能力显著下降,表明MYEOV在胰腺癌转移中发挥着重要的促进作用。MYEOV可能通过调控细胞外基质(ECM)降解酶的表达(如MMPs)来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。 在EMT过程中,细胞黏附分子(如E-cadherin)的表达降低,细胞间的黏附性减弱,从而增强了细胞的迁移能力。MYEOV的表达可能与这些过程密切相关,促进细胞从原位肿瘤向远处转移。 此外,MYEOV还可能通过影响细胞骨架的重组来增强细胞的运动能力。 细胞骨架的动态变化对于细胞迁移至关重要,而MYEOV的表达可能通过调控相关蛋白(如Vimentin)来影响细胞形态和运动。 本研究发现,MYEOV的敲除导致Capan-2细胞中Vimentin的表达降低,E-cadherin的表达上升,表明EMT过程受到抑制,为目前首次相关报道。 推测MYEOV可能通过调节转录因子来影响EMT的激活。 这些转录因子在低氧微环境中通过HIF信号通路被激活,促进EMT相关基因的表达,进而提升肿瘤细胞的转移能力。MYEOV的存在可能增强这些转录因子的表达或活性,从而促进EMT的发生。 因此,MYEOV可能成为胰腺癌的潜在生物标志物和治疗靶点。 针对MYEOV的靶向治疗可能为胰腺癌患者提供新的治疗选择,提高治疗效果。

3. 3低氧微环境通过MYEOV调控胰腺癌细胞

在低氧微环境下,Capan-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显上升,而MYEOV敲除后,这些能力的增强受到抑制。 该结果表明,低氧通过MYEOV调控胰腺癌的进展。 根据本研究结果推测,低氧可能上调MYEOV的表达,从而形成恶性循环———低氧微环境促进MYEOV表达,MYEOV又促进细胞的侵袭与转移。 本研究中小鼠体内研究结果表明,Capan-2-MYEOV-/ -FL移植组的肿瘤体积明显小于Capan-2-FL组,进一步证实了MYEOV在胰腺癌肿瘤生长中的促进作用。 免疫组化检测显示,敲除MYEOV后,肿瘤组织中EMT水平的激活程度显著下降,为本研究的猜测提供了进一步的证据,表明MYEOV在EMT过程中的重要性。EMT的抑制进一步导致细胞迁移和侵袭能力的下降,从而抑制了胰腺癌的进展。总的来说,以上结果相结合,支持了MYEOV作为潜在治疗靶点的可行性,提示在胰腺癌的治疗中,抑制MYEOV的表达可能有效抑制肿瘤生长和转移。

综上所述,本研究结果揭示了低氧微环境通过MYEOV介导胰腺癌转移的机制。MYEOV在低氧微环境件下的表达上调不仅促进了肿瘤细胞的增殖和转移,还通过激活EMT过程增强了细胞的侵袭能力,这些发现为胰腺癌的生物学特性提供了新的见解,并为未来的治疗策略指明了方向。 未来的研究应集中在MYEOV的下游信号通路的具体机制,以及如何有效抑制MYEOV的表达,以开发新的治疗方法上。 通过靶向MYEOV及其相关通路,可能为胰腺癌患者提供新的治疗选择。

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金项目(2021MS08051);包头医学院青年科技人才发展项目(BYJJ-DXK2022016);

文章来源:冯月兰,张伟,李小刚.低氧微环境通过MYEOV介导胰腺癌转移的机制探究[J].医学理论与实践,2025,38(06):918-922+926.