胰腺癌是一种最具侵袭性的消化系统恶性肿瘤，尽管经过几十年的努力，胰腺癌的预后仍然很差，死亡率与发病率相当，是癌症相关死亡的第六大原因。目前，该病的治疗主要依靠手术、放疗和化疗[1]。但副作用严重，疗效有限。因此，寻找低毒性天然活性物质是目前医学界的研究重点之一。研究发现，一些针对特定信号通路的天然提取物可在不同阶段抑制或延缓癌变过程，具有靶向特异性、细胞毒性低、易诱导癌细胞凋亡等特点[2]。

GTP酶激活蛋白结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein binding proteins, G3BP1)是一种参与多种生物学功能的多功能结合蛋白，参与细胞增殖、转移、凋亡、分化和RNA代谢[3]。在各种癌症中，G3BP1是一种促癌因子，可以促进癌细胞的增殖、侵袭和转移。此外，与正常组织相比，G3BP1在肿瘤组织中的表达更高，可以作为癌症诊断的指标[4]。研究显示，G3BP1参与多种信号通路调控癌症的发生和进展，包括Ras信号通路、NF-κB信号通路[5]。然而，它们在促进胰腺癌增殖和转移中的相互作用尚未得到很好的表征。

岩藻多糖(Fucoidan)来源于褐藻，是一类含有岩藻多糖和硫酸基团的多糖，在基础研究中显示出广泛的生物活性，包括抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗幽门螺杆菌等，具有生物活性高、来源广、耐药低、副作用小等优点，被用作新型抗肿瘤药物或与抗肿瘤药物联合使用的佐剂[6]。然而，岩藻多糖是否能通过调控G3BP1/NF-κB影响胰腺癌细胞增殖仍不清楚。本研究的目的是确定胰腺癌中G3BP1和NF-κB相互作用的表达模式，并评估岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响，从而阐明其潜在的机制。

1、材料与方法

1.1 动物和细胞株

SPF级BALB/c 裸鼠，雄性，4周龄，体重15～20 g, 购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，SCXK(豫)2020-0005。人胰腺癌capan-1细胞株购自齐氏生物科技有限公司。

1.2 药物及试剂

岩藻多糖(Fucoidan, 南京景竹生物科技有限公司),溶于0.1%二甲基亚砜中，培养基稀释；动物实验时，采用PEG400溶解，生理盐水稀释，4 ℃保存备用。

MTT细胞活力检测试剂盒(南京建成生物研究所);G3BP1siRNA、pcDNA3.1-G3BP1、慢病毒shRNA稳转试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)。兔抗人G3BP1、p-NF-κBp65、NF-κBp65、IκBα和β-actin抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗(美国，Sigma公司)。Protein A/G珠(Santa Cruz Biotechnology, USA)。

1.3 仪器

莱卡倒置荧光显微镜(德国徕卡公司);MK3酶标仪(赛默飞世尔科技公司)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

人胰腺癌细胞capan-1采用DMEM培养基培养，培养基含有10%的FBS,100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，37 ℃ 5%二氧化碳培养箱孵育。

1.4.2 MTT法

对数期胰腺癌细胞接种于96 孔板(5×103个/孔),100 μL /孔。细胞贴壁后，加入终浓度分别为1、2、4、8、16、32 μg/mL的岩藻多糖，另外设置对照组(0.1%DMSO)和只加培养基的空白对照组，每组三个重复，孵育48 h, 每孔加入20 μL MTT,培养4 h, 酶标仪于波长490 nm测量每孔的光密度(OD)值。按下式计算抑制率，抑制率=(药物组OD值-对照组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。实验重复三次。

1.4.3 G3BP1在胰腺癌组织中的表达水平及与生存率的关系分析

采用GEPIA数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn/)分析G3BP1在胰腺癌组织中的表达水平及与生存率的关系。

1.4.4 qRT-PCR实验

使用TRIzol试剂提取总RNA,并逆转录成 cDNA。内参基因选择GAPDH,采用基于 SYBR Green 的定量检测系统(Bio-Rad)进行 PCR 扩增。G3BP1引物序列：上游序列：5'-AAAGACTTGCCTGGGGGTTT-3',下游序列：5'-GCCACCACCAAGGAAAGGTA-3',139 bp; GAPDH 引物序列：上游序列：5'-CTCAGACACCATGGGGAAGG-3',下游序列：5'-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3',207 bp; PCR反应条件：95 ℃ 20 s, 95 ℃10 s, 60 ℃30 s, 70 ℃1 s, 共40个循环。2-ΔΔCt法计算G3BP1的相对表达水平。

1.4.5 Western blot实验

细胞裂解液采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液制备，蛋白浓度采用Bradford assay kit测定。调整后的蛋白样品与上样缓冲液混合，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上电泳。电泳后，蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1 h。参照说明书，给予G3BP1(1∶1 000)、p-NF-κBp65(1∶2 000)、NF-κBp65(1∶2 000)、IκBα(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗在4 ℃下孵育过夜，TBST洗涤三次，加二抗孵育1 h, TBST洗涤三次后，采用ECL法观察印迹。

1.4.6 免疫共沉淀实验

胰腺癌细胞capan-1细胞用2 mL PBS洗涤1次， 850×g室温离心5分钟收集细胞。然后用裂解缓冲液裂解细胞。裂解液与特异性抗体和对照lgG+Protein A/G珠在4 ℃下孵育2小时。用PBS洗涤珠3次后，免疫沉淀采用Western blot分析。

1.4.7 敲低G3BP1及分组细胞分组如下

对照组(未作任何处理)、阴性对照组(si-NC,转染G3BP1阴性序列，5'-ACUUCAGUCUAAGUUGGCUUG-3' )、G3BP1 siRNA组(转染G3BP1基因干扰序列，5'-ACUCAGUUCUAUCUAGUUGGG-3' )、岩藻多糖组(8 μg/mL)和岩藻多糖(8 μg/mL)+G3BP1 siRNA组(转染G3BP1基因干扰序列),采用LipofectamineTM2000将干扰序列转染至对数生长期胰腺癌capan-1细胞，培养6 h后，加入终浓度为8 μg/mL的岩藻多糖。孵育48 h, MTT法检测细胞抑制率，Western blot法分析G3BP1、p-NF-κBp65、NF-κBp65和IκBα水平。

1.4.8 上调G3BP1及分组

细胞分组如下：对照组(未作任何处理)、阴性对照组(pcDNA3.1,转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-G3BP1组(转染pcDNA3.1-G3BP1)、岩藻多糖组(8 μg/mL)和岩藻多糖(8 μg/mL)+pcDNA3.1-G3BP1组(转染pcDNA3.1-G3BP1),采用LipofectamineTM2000将质粒转染至对数生长期胰腺癌capan-1细胞，培养6 h后，加入终浓度为8 μg/mL的岩藻多糖。孵育48 h, MTT法检测细胞抑制率，Western blot 法分析G3BP1、p-NF-κBp65、NF-κBp65和IκBα水平。

1.4.9 裸鼠急性毒性实验

设置给药最小剂量(Dm)和最大剂量(Dn),采用等比数列设置5组(r=0.75),每组10只，腹腔注射，1次/天，持续14天。采用SPSS 21.0软件计算LD50。

1.4.10 移植瘤实验

将裸鼠随机分为模型组(生理盐水)、G3BP1 shRNA组、岩藻多糖组和岩藻多糖+G3BP1 shRNA组、5-FU组(20 mg/kg, 预实验获得)。将0.2 mL含2×105个稳定表达G3BP1 shRNA细胞或正常的capan-1细胞接种到BALB/c 裸鼠的侧腹，每组6只。当肿瘤达到100 mm3时，采用腹腔给药，岩藻多糖给药剂量为50 mg/kg, 1次/3 d, 每周采用游标卡尺评估肿瘤大小。肿瘤体积=宽度2×长度/2。第21天，对肿瘤进行解剖、拍照和称重。并分析肿瘤中的G3BP1、p-NF-κBp65、NF-κBp65和IκBα水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响

图1显示，1～32 μg/mL的岩藻多糖孵育胰腺癌capan-1细胞48 h, 结果显示具有显著的抑制作用(F=21.372,P<0.05)。SPSS 21.0软件计算IC50值为7.729 μg/mL,后续选择2、4、8 μg/mL进行实验。

图1 岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响  

2.2 G3BP1在胰腺癌组织中的表达水平及与生存率的关系

G3BP1在胰腺癌肿瘤组织中的表达明显高于正常组织(图2A)。然后，通过Kaplan-Meier绘图数据库分析基于G3BP1表达的胰腺癌预后。G3BP1高表达患者的生存率低于G3BP1低表达患者(图2B)。

2.3 岩藻多糖对胰腺癌细胞G3BP1/NF-κB信号通路的影响

胰腺癌细胞给药孵育48 h后，与对照组比较，2、4、8 μg/mL的岩藻多糖能显著降低G3BP1、p-NF-κBp65水平，增加IκBα水平(图3)。

2.4 免疫共沉淀检测G3BP1与p-NF-κBp65之间相互作用

Co-IP 实验发现G3BP1与p-NF-κBp65相互结合，并且岩藻多糖作用后结合能力降低(图4)。

2.5 G3BP1低表达促进了岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响

胰腺癌细胞给药孵育48 h后，与对照组比较，si-NC组G3BP1表达水平无统计学差异(P>0.05),G3BP1 siRNA组G3BP1表达水平显著降低(图5A,P<0.01);与 对照组比较，岩藻多糖 组(8 μg/mL)和岩藻多糖(8 μg/mL)+G3BP1 siRNA组抑制率显著增加(图5B),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调(图5C-D,P<0.05);与岩藻多糖组(8 μg/mL)比较，岩藻多糖(8 μg/mL)+G3BP1 siRNA组抑制率显著增加(图5B),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调(图5C-D,P<0.05)。

图2 G3BP1在胰腺癌组织中的表达水平(A)及与生存率(B)的关系   

图3 岩藻多糖对胰腺癌细胞G3BP1/NF-κB信号通路的影响   

图4 免疫共沉淀检测G3BP1与p-NF-κBp65之间相互作用   

图5 G3BP1低表达促进了岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响   

2.6 G3BP1高表达逆转了岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响

胰腺癌细胞给药孵育48 h后，与对照组比较，pcDNAG3.1组G3BP1表达水平无统计学差异(P>0.05),pcDNAG3.1-G3BP1组G3BP1表达水平显著增加(图6A,P<0.01);与对照组比较，岩藻多糖组(8 μg/mL)和岩藻多糖(8 μg/mL)+pcDNAG3.1-G3BP1组抑制率显著增加(图6B),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调(图6C-D,P<0.05);与岩藻多糖组(8 μg/mL)比较，岩藻多糖(8 μg/mL)+pcDNAG3.1-G3BP1组抑制率显著降低(图6B),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著上调，IκBα水平下调(图6C-D,P<0.05)。

2.7 裸鼠急性毒性实验结果

裸鼠急性毒性实验结果通过SPSS 21.0软件分析，LD50为976.79 mg/kg, 95%可信限为(838.15～1 141.15)mg/kg, 毒性基本较小。选择LD50的1/20进行后续实验，即50 mg/kg(表1)。

表1 急性毒性实验

2.8 G3BP1低表达促进了岩藻多糖在体内对胰腺癌肿瘤的影响

建模成功后的裸鼠，给药21 d后，与模型组比较，治疗前各组肿瘤体积差异无统计学意义(图7B,P>0.05);与模型组比较，第7 d、14 d、21 d 5-FU组、岩藻多糖组(50 mg/kg)和岩藻多糖(50 mg/kg)+G3BP1 shRNA组肿瘤体积显著下调(图7B,P<0.01);与模型组比较，岩藻多糖组(50 mg/kg)和岩藻多糖(50 mg/kg)+G3BP1 shRNA组肿瘤质量显著降低(图5C),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调(图7D-E,P<0.05);与岩藻多糖组(50 mg/kg)比较，岩藻多糖(50 mg/kg)+G3BP1 shRNA组肿瘤质量显著降低(图7C),G3BP1、p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调(图7D-E,P<0.05)(图7)。

图6 G3BP1高表达逆转了岩藻多糖对胰腺癌细胞增殖的影响   

图7 G3BP1低表达促进了岩藻多糖在体内对胰腺癌肿瘤的影响   

3、讨论

目前，G3BP1已被报道在多种类型的癌症中高表达，包括乳腺癌、细胞淋巴瘤、肾细胞癌、小细胞肺癌、鼻咽癌、食管癌和肝细胞，促进胶质瘤和乳腺癌在体内的侵袭性[7,8]。其驱动肿瘤的生长和转移与多种肿瘤发生、转移以及生长相关信号通路有关，包括NF-κB、Ras信号和泛素蛋白酶体系统[9]。因此，G3BP1可作为药物抑癌的靶点。最近的研究表明，从海洋海藻中提取的岩藻多糖具有多维抗癌的潜力，并且已经发现它对正常细胞无毒，但其对胰腺癌的研究及其机制知之甚少[10]。本研究中，1～32 μg/mL的岩藻多糖对胰腺癌capan-1细胞具有显著的抑制作用，裸鼠移植瘤实验也证实了岩藻多糖抑瘤效果明显。另外，WB实验证明2、4、8 μg/mL的岩藻多糖能显著降低G3BP1、p-NF-κBp65水平，增加IκBα水平，另外体内实验结果与上述一致，说明一定浓度的岩藻多糖能通过调控G3BP1/NF-κB信号通路影响胰腺癌细胞的增殖。

G3BP1被鉴定为68 kDa的蛋白，主要表达于细胞质中，但该蛋白也具有进入细胞核的能力，可以调控细胞一系列与转移相关的特性，包括趋化性、迁移、高尔基极性定位和肌动蛋白聚合[11]。参与调节与细胞生长、分化、凋亡和细胞骨架重塑相关的各种细胞功能，这表明G3BP1可能是肿瘤发生和发展的重要调控分子[12]。Northern blotting和免疫组织化学分析显示G3BP1在胰腺癌、乳腺癌、肺癌中的表达升高[13],这些证据表明，G3BP在一系列癌症中的特异性过表达，可能是抗癌药物的候选靶点[14]。前面的实验已经证实了岩藻多糖作用后能够影响G3BP1的表达水平，并且岩藻多糖的作用效果与细胞中G3BP1的表达水平相关，推测G3BP1可能是岩藻多糖作用的靶点。接下来为了验证这一推测，进行了 Co-IP 实验发现G3BP1与p-NF-κBp65能够相互结合，并且岩藻多糖作用后结合能力下调，说明岩藻多糖作用后通过影响G3BP1的表达水平，进而影响了G3BP1与p-NF-κBp65之间的相互作用，导致p-NF-κBp65表达水平下调，从而发挥抗癌的作用。而且本研究中，G3BP1敲除和过表达，均对胰腺癌capan-1细胞的增殖产生影响，并进一步影响岩藻多糖对capan-1细胞增殖抑制效果，其中岩藻多糖+G3BP1 siRNA组较岩藻多糖组细胞增殖抑制率显著上调，而岩藻多糖+pcDNAG3.1-G3BP1组细胞增殖抑制率显著下调，说明G3BP1是岩藻多糖发挥抗胰腺癌的靶点，同样体内实验也证明了上述的观点。

核转录因子κB(NF-κB)参与了许多癌症的进展，NF-κB被抑制蛋白IκB隔离在细胞质中，使其失去活性[15]。一旦从其抑制剂中释放出来，NF-κB易位到细胞核，结合到特定的启动子位点调节与肿瘤发生和肿瘤进展相关的许多基因的转录[16]。NF-κB是赋予胰腺癌细胞凋亡抗性的关键因素之一。据报道，它在胰腺癌细胞中被组成性激活，但在正常胰腺组织中不被激活[17]。多项研究表明，抑制NF-κB可抑制胰腺癌细胞的存活并使其对化疗敏感。NF-κB的组成性激活通过诱导抗凋亡基因和/或抑制促凋亡基因来抑制细胞凋亡[18]。虽然已知NF-κB可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，但其具体调控还有待进一步研究。已有研究表明，G3BP1能通过NF-κB信号通路影响肿瘤的生长和转移[11]。因此，本研究分析了胰腺癌细胞中G3BP1和NF-κB信号通路互作情况以及对岩藻多糖药效的影响。结果显示，沉默或者G3BP1过表达均对岩藻多糖抗增殖效果产生明显作用。而WB实验表明，岩藻多糖+G3BP1 siRNA组p-NF-κBp65水平较岩藻多糖组显著下调，IκBα水平上调，而岩藻多糖+ pcDNAG3.1-G3BP1组较岩藻多糖组p-NF-κBp65水平显著下调，IκBα水平上调，说明G3BP1可能通过NF-κB信号通路影响胰腺癌细胞增殖，而岩藻多糖可通过G3BP1的耗竭调控NF-κB信号通路的失活抑制胰腺癌细胞的增殖。

总之，G3BP1在胰腺癌中高表达，是岩藻多糖发挥抗癌作用的靶点，其机制与调控NF-κB信号通路有关，可以为岩藻多糖的开发提供依据。当然，本实验对岩藻多糖对胰腺癌调节机制的研究是有限的，有待进一步进行研究。

基金资助:河南应用技术职业学院校级课题(编号:2023-KJ-66);河南应用技术职业学院“首席技师”资助项目(编号:2022-SXJS-YY01);2022年度河南省职业教育教学改革研究与实践项目重点课题(编号:豫教[2023]02979);2023年河南省开封市科技发展计划科技攻关项目(社会发展类)(编号:2303063);

文章来源:李元元,唐贝,李烨,等.岩藻多糖调控G3BP1/NF-κB信号通路影响胰腺癌细胞增殖[J].现代肿瘤医学,2024,32(09):1615-1621.