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FAM25A在胰腺癌中临床价值及潜在机制的生物信息学分析

2024-04-24 67 上传者：管理员

摘要：目的:通过生物信息学方法，探究FAM25A对胰腺癌的诊断、预后价值，分析其与免疫浸润相关性，并对该基因在胰腺癌中发生发展的潜在作用机制进行阐述。方法:从TCGA、GTEx和GEO数据库获取胰腺癌数据集，Rstudio用于数据分析和可视化。明确FAM25A的表达差异，采用K-M分析FAM25A的表达与胰腺癌总生存时间的关系，Cox回归分析FAM25A表达与胰腺癌预后因素的相关性，分析FAM25A表达与免疫细胞浸润的相关性。根据WGCNA将与FAM25A和肿瘤纯度最相关的模块基因导入STRING构建PPI网络并获取GO和KEGG,采用GSEA分析FAM25A高低表达的富集通路，利用Cytoscape中MOCDE聚类子网络获取显著相关的节点，综合以上信息分析FAM25A在胰腺癌中的潜在机制。结果:差异分析提示FAM25A在胰腺癌中高表达具有统计学意义(P<0.01);K-M分析结果显示FAM25A高表达患者的生存期明显短于低表达患者；对胰腺癌预后相关因素进行Cox回归分析，结果提示FAM25A为胰腺癌的独立危险因素(HR=2.4, 95%CI=1.614-3.592);免疫细胞浸润相关性分析显示FAM25A可以降低T淋巴细胞水平；GO、KEGG、GSEA和MCODE结果表明FAM25A主要在细胞与细胞间相互作用、细胞间信号产生与转导、趋化因子及免疫反应等相关途径中发挥作用。结论:FAM25A在胰腺癌中过表达是胰腺癌一个独立的不良预后因子，FAM25A异常表达可以作为胰腺癌诊断和判断预后的生物标志物，其生物学效应可能是通过促进胰腺癌的增殖、侵袭和转移实现的。

关键词：
FAM25A
WGCNA
基因富集分析
生物信息学分析
胰腺癌
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胰腺癌(pancreatic cancer, PAAD)是恶性程度极高的消化道肿瘤[1],并且罹患人数逐年递增[2]。PAAD起病隐匿，早期缺乏特异症状和有效诊断的生物标志物，因而多数患者确诊PAAD时已属中晚期。PAAD手术切除范围广，对患者创伤极大，且术后胰腺癌局部复发和多处转移导致PAAD患者的总体五年生存率仅为7%[3,4]。因此，寻找一种新型敏感的生物标志物对胰腺癌患者具有重要的临床意义。家族序列相似性基因25A(family with sequence similarity 25 member A ,FAM25A)是位于10号染色体的蛋白质编码基因，于2004年首次被检测到[5]。目前，针对FAM25A在PAAD中的作用鲜有报道。因此，本研究基于TCGA、GTEx和GEO数据库，明确FAM25A在PAAD中表达情况，分析其对PAAD的诊断价值、免疫细胞浸润相关性、预后评估价值，通过加权基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis, WGCNA)和富集分析进一步预测其共表达基因以及在胰腺癌中的潜在作用机制，为研究FAM25A在PAAD发生、发展过程中的作用提供新的理论基础。

1、资料与方法

1.1 数据采集与处理

本研究中涉及的PAAD转录组数据和患者临床数据来源为肿瘤基因组图谱(the Cancer Genome Alas, TCGA)、基因型-组织表达数据库(The Genotype-Tissue Expression ,GTEx)和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)。基于生物信息学方法对TCGA-PAAD数据库中178例肿瘤组织和4例癌旁组织以及GTEx中与之相对应的167例正常组织进行数据统计和可视化分析，并采用GEO数据库中GSE60979(49例肿瘤组织样本和12例正常组织样本)进一步验证FAM25A的表达差异和诊断价值。

1.2 差异表达分析

采用“DESeq2”R包进行数据处理[6,7],探究FAM25A在癌症组织和癌旁组织中的表达差异(|log2FoldChange|> 2, P< 0.05)。本研究利用TCGA和GTEx联合分析FAM25A表达数据(TCGA癌症组织178例，TCGA癌旁组织4例，GTEx正常组织167例),以P< 0.05为差异有统计学意义。

1.3 单因素与多因素Cox回归分析

将获取的临床数据和FAM25A进行单因素Cox分析，根据P值，将P<0.1的临床变量再次进行多因素Cox回归分析[7],计算各临床特征的HR和95%CI,P<0.05认为该临床特征可视为PAAD的独立预后因子。

1.4 预后评价与K-M生存分析

根据FAM25A的中位表达值，将患者分为高(High FAM25A TPM)低(Low FAM25A TPM)两组。通过“SurvivalR”包绘制ROC曲线，同时计算ROC曲线下面积AUC值。在AUC>0.5的情况下，AUC越趋近于1,说明诊断效果越好[7]。使用K-M方法对PAAD高(High FAM25A TPM)低(Low FAM25A TPM)两组的生存期进行比较，统计学方法选用Log-rank。在P<0.05的情况下，生存曲线离散度越高，表明FAM25A高低表达组的生存差异越显著[8]。

1.5 FAM25A与免疫细胞浸润相关性

采用“cibersort”R包分析22种免疫细胞在胰腺癌组织中的相对百分比，通过“ssGSEA”R包分析FAM25A高水平与低水平表达同免疫细胞浸润的相关性[9],以P<0.05为差异具有统计学意义，r>0为正相关，r<0为负相关。

1.6 WGCNA和PPI分析

采用“WGCNA”R包构建基因共表达网络，选择合适的加权系数β,使生成的共表达网络具有无尺度特性。使用β将相关矩阵转换为拓扑重叠矩阵(Topological Overlap Matrix, TOM),以识别基因模块。基因模块的最小基因数为30,采用合适的切割阈值合并相似基因模块[10]。通过STRING(https: //string-db.org/)构建基因模块基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络关系(protein-protein interaction network, PPI)以识别蛋白质之间的相互作用，最低可信度为0.9。采用Cytoscape 3.9.1进行共表达网络的可视化分析，运用MCODE插件聚类与FAM25A表达以及PAAD肿瘤纯度相关的子网络模块(degree cutoff=2,node score cutoff=0.2,k-score=2,max Depth=100)。

1.7 富集分析

基于STRING在线工具对选中模块内基因进行GO功能注释和KEGG通路分析[11],其中GO功能注释包括生物过程、分子功能、细胞组成三个部分，根据P值进行排序，保留前15条生物功能注释、前10条分子功能注释和前10条细胞组成注释，KEGG通路分析保留全部P<0.05的通路，并采用GSEA分析FAM25A高低表达组的富集通路[12]。通过综合以上信息，研究FAM25A在胰腺癌中潜在作用机制。

2、结果

2.1 FAM25A的诊断价值和验证

差异表达分析显示，PAAD组织的FAM25A的mRNA表达量明显高于癌旁组织(P<0.01);ROC曲线下面积(AUC)为0.8,提示FAM25A可能是一种良好的诊断性生物标志物。GEO数据库差异表达分析GSE60979数据集，结果进一步验证了FAM25A对PAAD的诊断价值。综合上述差异分析结果提示可以通过检测FAM25A的表达值判断PAAD是否发生，对PAAD的诊断具有重要价值。见图1。

2.2 FAM25A的预测价值

针对FAM25A高低表达组的K-M生存分析显示，FAM25A基因高表达组的总生存时间明显短于低表达组。在调整TNM分期、性别、组织学分级等临床变量后，多因素Cox回归分析提示FAM25A可以作为PAAD的独立危险因素(P<0.01)。综上所述，FAM25A与PAAD患者临床结局有关联，能够成为预测PAAD的临床指标。见图2,表1。

图1 FAM25A在胰腺癌中的诊断价值和验证

图2 FAM25A在胰腺癌中的预测价值—FAM25A高低表达组K-M生存分析图

2.3 FAM25A与免疫细胞浸润的相关性

通过cibersort分析胰腺癌组织中22种免疫细胞的相对百分比，通过ssGSEA分析胰腺癌中FAM25A的表达水平与免疫细胞浸润相关性发现，FAM25A表达与Th2细胞正相关，与TFH细胞、pDC细胞、T细胞等免疫细胞负相关。分组比较图(r=-0.22,P<0.01)和散点图(P<0.05)显示FAM25A的表达与组织内富集T细胞以及T细胞富集分数负相关，提示FAM25A高表达组内T细胞水平低于FAM25A低表达组T细胞水平。见图3。

表1 胰腺癌单因素与多因素Cox回归分析

图3 FAM25A表达与肿瘤免疫浸润水平的相关性

2.4 筛选与FAM25A有关的模块与基因

通过建立加权基因共表达网络(β=6)筛选与FAM25A有关的基因，从TCGA数据库的胰腺癌和癌旁组织筛选出2 863个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)进行WGCNA,经过一系列变量调整后，2 863个DEGs被聚类为14个模块(见图4A-4E)。依据肿瘤纯度(r=0.8, P<0.01) 和FAM25A的相关性(r=0.49, P<0.01) ,选择包含有513个基因的蓝色模块。共有38个基因被选为蓝色模块的关键基因[MM(absolute module membership)>0.8 and GS(absolute gene significance)>0.5]。见图4F。

2.5 分析FAM25A在胰腺癌中的潜在机制

为进一步预测FAM25A基因在PAAD恶性进程中可能参与的信号通路，通过对肿瘤纯度和FAM25A相关性最高的蓝色模块进行GO和KEGG富集分析。GO功能注释显示含有513个基因的蓝色模块与角质化、免疫反应、细胞通讯、细胞黏附、信号转导等生物功能，C-C趋化因子结合和受体活性、细胞因子结合、免疫受体活性等分子功能以及细胞外区域、核小体等细胞组成具有一定相关性。KEGG通路分析提示蓝色模块与细胞因子和受体间相互作用有明显富集。通过构建PPI网络，运用MCODE聚类子网络，呈现与FAM25A相关性显著的节点并以表格形式呈现。见图5,表2。

图4 胰腺癌中FAM25A相关模块及基因筛选

图5 FAM25A在胰腺癌中的潜在机制

表2 MCODE插件结果

2.6 GSEA通路富集分析

通过对差异基因集合进行GSEA通路富集分析，明确FAM25A低表达组与高表达组之间的功能差异。中间丝细胞骨架主要富集在FAM25A高表达组，细胞与细胞间信号发放、细胞连接、信号释放主要富集在FAM25A低表达组，提示FAM25A高表达与PAAD的演化和进展密切相关。见图6。

3、讨论

PAAD因其高发病率和高死亡率成为全球恶性程度最高的肿瘤之一[1]。由于缺乏有效诊断标志物且肿瘤进展十分迅速，因此确诊为PAAD的患者大多已演进为癌症晚期。PAAD常用的肿瘤标志物为CA19-9,然而CA19-9早期升高不明显，且CA19-9在很多消化道肿瘤患者中均有升高现象，因而不具有辅助诊断PAAD的临床价值[13]。PAAD的发生是多基因和多途径驱动的过程[14]。通过对人类全基因组数据筛选肿瘤标志物，可以用于诊断和判断预后，也可用于研究肿瘤潜在演进机制。近年来，有研究报道FAM25A基因的表达与早期舌癌的发生发展具有一定相关性[15]。然而，目前尚未有研究对FAM25A与PAAD的相关性进行阐述。本研究目的是利用公共数据库，分析PAAD与FAM25A的关系，揭示其在PAAD中的潜在作用机制。希望通过本研究，能缩小实验目的基因筛选范围，为实验验证提供理论基础。

图6 GSEA富集分析

本研究结果显示，FAM25A在PAAD与正常组织之间具有明显的表达差异，FAM25A可以作为PAAD诊断和预后的生物标志物。通过将FAM25A作为模型基因纳入预后模型发现该基因与PAAD的预后呈显著负相关。根据这一结果，本研究利用WGCNA和PPI对FAM25A及其相关基因进行多方位评估，从而系统地研究了FAM25A在PAAD中潜在机制。综合富集信息结果显示FAM25A主要在细胞与细胞间相互作用、信号转导、趋化因子和免疫反应等相关途径中发挥作用。有学者认为胰腺星状细胞和PAAD相互作用促进癌症进展。PAAD组织能促进胰腺星状细胞活化，同时胰腺星状细胞又能促进其增殖、侵袭、转移、免疫抑制以及PAAD中新生血管的形成，改变肿瘤微环境，影响PAAD预后[16]。FAM25A及其相关基因可以影响细胞间相互作用，下调细胞间信号转导和细胞连接，这可能是引起PAAD发生发展的潜在原因之一。趋化因子与胰腺癌的进展也密不可分，研究表明趋化因子可以抑制PAAD的生长，是PAAD生长的关键媒介[17]。FAM25A富集通路显示其可以影响CC亚族趋化因子结合及其受体活性，该亚族趋化因子与PAAD的分化程度有关，CC亚族趋化因子受体配体阳性率越高，PAAD的分化程度越低，且CC亚族趋化因子还参与了胰腺癌炎性微环境的形成与维持[18]。MCODE聚类子网络显示FAM25A与组蛋白基因家族最具相关性，GSEA富集分析还显示FAM25A高表达与中间丝细胞骨架通路正相关。组蛋白是染色体中核小体的基本蛋白，中间丝是细胞骨架中最具有张力的部分，细胞分裂及增殖与这些物质关系密切[19,20],Andrew等人[21]发现随着细胞内波形蛋白(Ⅲ型中间丝蛋白)网络去稳定并在细胞核周围重新组织，可以降低细胞间纠缠，这种空间位阻减少常足以解除肌动蛋白细胞骨架的束缚，促进细胞迁移，由此可知，FAM25A可能通过上调中间丝通路和控制组蛋白基因家族表达从而影响PAAD的增殖和转移。FAM25A在系统性红斑狼疮的KEGG富集通路提示其可能与免疫相关，特异性免疫细胞尤其是T细胞在人体内发挥免疫监视作用，免疫细胞相关性分析还显示FAM25A可以促使PAAD内Th2细胞数目增多，使组织内Th1/Th2比例失衡，抑制T细胞活化，加之FAM25A对TFH细胞的抑制作用，共同降低组织内T细胞水平，重塑了PAAD组织的免疫微环境[22]。过度饮酒是胰腺癌的危险因素，FAM25A及其相关基因与酗酒行为有关，这提示该基因可能介导了危险因素对PAAD的持续作用[23]。

然而，本研究也有一定的局限性。由于TCGA是唯一一个对PAAD基因表达和预后都有足够数据的公共数据库，因而无法利用其他独立样本来验证FAM25A在PAAD中的预后价值。其次，本研究结果仅通过生物信息学分析了FAM25A在PAAD中的临床价值和机制，该结论尚未进一步得到实验证实。

综上所述，FAM25A在PAAD中过表达可能是PAAD一个独立的不良预后因子，过表达FAM25A可以作为PAAD的诊断和预后生物标志物，其可能通过细胞与细胞间相互作用、细胞信号的产生与转导、趋化因子和免疫反应等相关途径促进PAAD发生和进展。对癌症基因FAM25A的研究有助于了解PAAD,为研究PAAD提供参考。

参考文献:

[4]中华医学会肿瘤学分会.胰腺癌早诊早治专家共识[J].临床肝胆病志,2020,36(12):2675-2680.

[16]章洪鹏,汤东,王道荣.胰腺星状细胞与肿瘤细胞相互作用的研究进展[J].国际外科学杂志,2018,45(9):641-644.

[18]王宇鹏,李彩霞,张淑坤.CC亚族趋化因子配体20与胰腺癌[J].中国中西医结合外科杂志,2017,23(1):101-103.

文章来源:赵益浩,马兴燕,张栋斌.FAM25A在胰腺癌中临床价值及潜在机制的生物信息学分析[J].包头医学院学报,2024,40(04):59-66+81.