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β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响

2024-06-17 62 上传者：管理员

摘要：目的分析β-catenin蛋白在胰腺癌干细胞恶性生物学特性维持过程中的作用及其机制。方法分离培养原代胰腺癌细胞，将胰腺癌细胞分为NC组和AD β-catenin组，NC组细胞转染阴性空载病毒，AD β-catenin组细胞转染β-catenin过表达慢病毒载体。采用流式细胞仪分析细胞株肿瘤干细胞表面标志物CD24、CD44及ESA的表达情况；分选出CD24+CD44+ESA+细胞并扩大培养，通过检测分选出细胞的成球能力、克隆形成能力、增殖能力、侵袭迁移能力、细胞周期及凋亡情况；分析β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响。结果 AD β-catenin组细胞中β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量显著高于NC组(P=0.016,P=0.015)。流式细胞仪分析结果显示，AD β-catenin组细胞中CD24+及CD24+CD44+ESA+的细胞率显著高于NC组(P<0.05)。与NC组比较，AD β-catenin组胰腺癌干细胞克隆形成能力、成球能力、侵袭与迁移细胞数均显著增加(P<0.05)。AD β-catenin组细胞在24 h、48 h及72 h的光密度(OD)值均显著高于NC组(P<0.05)。与NC组相比，AD β-catenin组G0/G1期细胞比例显著减少(P<0.05),S期细胞比例增高(P<0.05)。AD β-catenin组的细胞凋亡率显著低于NC组(P<0.05)。结论 β-catenin通过提高胰腺癌原代细胞中CD24+CD44+ESA+的细胞率，促进胰腺癌干细胞成球能力，增强细胞增殖、侵袭与迁移能力，抑制细胞的凋亡，从而维持胰腺癌干细胞的恶性生物学特性。

关键词：
Wnt/β-catenin信号通路
β-catenin;胰腺癌原代细胞
临床问题
手术切除
胰腺癌干细胞
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胰腺癌是一种恶性肿瘤，其手术切除率低、术后放化疗效果差且易复发转移[1,2]。近年来，随着细胞分子生物技术的发展，人们对胰腺癌有了深入的研究，特别是对于胰腺癌干细胞的分子特性有了进一步理解。胰腺癌干细胞是肿瘤复发、耐药和转移的原因[3,4,5]。因此，研究胰腺癌干细胞的生物学特性对解决临床问题具有重要意义。

β-catenin是一种关键的细胞内信号蛋白，其在Wnt信号传导途径中调控细胞增殖、分化和迁移，起着核心作用[6]。研究表明，β-catenin的异常激活已被认定与多种癌症的发展密切相关，是癌症治疗的潜在靶点[6]。β-catenin的激活状态与胰腺癌的临床阶段、预后和化疗抗药性密切相关[6]。然而，β-catenin在胰腺癌干细胞中的作用及其影响胰腺癌生物学行为的机制尚不清楚。因此，本研究探讨β-catenin在胰腺癌干细胞的恶性生物学特性维持过程中的作用和机制，以期为临床研究提供基础理论依据。

1、材料与方法

1.1主要试剂

DMEN/F12培养基、RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；抗人CD24抗体、抗人/鼠CD44抗体、抗人ESA抗体购自美国Thermo公司；Cell Counting Kit-8细胞增殖/毒性检测试剂盒购自北京全式金生物公司；病毒助感染试剂HitransG P、阴性对照病毒CON238、β-catenin过表达慢病毒载体LV-CTNNB1购自上海吉凯基因公司；Giemsa染液购自南京建成公司；PI/RNase染色缓冲液、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、细胞基底胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2主要仪器

CO2细胞培养箱产自上海力康仪器有限公司；荧光倒置显微镜产自日本尼康公司；酶标仪产自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪（BD FACSAriaⅡ）产自美国BD公司。

1.3胰腺癌原代细胞的分离培养

胰腺癌组织来源于1例58岁男性患者。患者无其他恶性肿瘤及冠心病、高血压、糖尿病等基础疾病，未进行放化疗或其他抗肿瘤治疗。病理结果显示：胰腺导管细胞来源中分化癌未伴局部脉管侵犯和区域淋巴结转移。本研究已获得患者及其家属的知情同意并通过伦理委员会审核（伦理批号：202209018）。使用人胰腺癌组织来源细胞培养试剂盒分离和纯化获得胰腺癌原代细胞，细胞在完全培养基中生长至80%以上后按1∶2传代比例传8代[7]。

1.4人胰腺癌原代细胞过表达β-catenin细胞株构建

通过胰酶消化获得单细胞悬液后，设置阴性对照组（NC）和实验组（ADβ-catenin），分别加入阴性空载病毒和β-catenin过表达慢病毒载体。进行转染、纯化和稳定株筛选等，最终得到稳定表达β-catenin的细胞株。通过实时定量PCR和Western blot验证β-catenin的表达情况。

1.5胰腺癌干细胞分选与培养

经处理后的细胞分装至离心管中，制备单细胞悬液，加入标记细胞，并经流式细胞术分选出CD24+CD44+ESA+细胞群。将分选的细胞接种于无血清培养基中培养，待生长良好后按1∶2传代比例传1～3代。

1.6胰腺癌干细胞克隆形成能力

将上述单细胞悬液接种到6孔板中，每个孔培养200个细胞，每组3个复孔。15 d后固定、染色并拍照计数。

1.7胰腺癌干细胞成球能力检测

单细胞悬液（1×102/mL）按实验分组接种到6孔板中，细胞于无血清DMEM/F12培养液中培养15 d后，倒置显微镜观察并进行拍照计数。

1.8胰腺癌干细胞侵袭、迁移能力

取对数生长期的细胞，洗涤后悬浮并计数，调整浓度为2.5×104个/孔。将细胞悬液加入Transwell试剂盒上室，下室加入完全培养基，每组3个孔，培养72 h。固定、Giemsa染液染色后，显微镜下计数5个视野，统计结果。

1.9胰腺癌干细胞增殖能力

将单细胞悬液以5×104/mL的密度接种至96孔板，每孔100μL，每组5个复孔，培养24 h、48 h、72 h后弃去孔中培养基，每孔加入10μL CCK-8液继续在培养箱中孵育，1 h后用酶标仪测定450 nm处的光密度（optical density,OD）值。

1.1 0胰腺癌干细胞细胞周期分析

取单细胞悬液（5×104/mL）于4℃避光孵育30 min，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况，对细胞DNA含量和光散射进行分析。

1.11胰腺癌干细胞凋亡分析

于单细胞悬液（5×104/mL）加入5μLAnnexin V-FITC,4℃避光孵育15 min，再加入10μL PI染色液，4℃避光放置5 min后，进行流式细胞仪检测，分析细胞凋亡情况。

1.12统计分析

实验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，当资料不符合正态性及方差齐性时，采用非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1人胰腺癌原代细胞的分离与纯化

成功分离并传代培养的胰腺癌原代细胞见图1。镜下可见胰腺癌原代细胞形态呈成纤维性、贴壁生长，经支原体衣原体试剂盒鉴定均为阴性。

2.2人胰腺癌原代细胞过表达β-catenin细胞株中β-catenin的表达情况

ADβ-catenin组细胞中β-catenin mRNA及蛋白相对表达量显著高于NC组（P=0.016,P=0.015），见图2。

图1胰腺癌原代细胞光学形态与波形蛋白鉴定图片（×200)

2.3β-catenin过表达对胰腺癌干细胞表面标志物表达的影响

ADβ-catenin组CD24+及CD24+CD44+ESA+细胞率显著高于NC组（P<0.05），而2组CD44+与ESA+细胞率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图3、表1。

图2不同处理组细胞中β-catenin表达检测

图3流式细胞鉴定图

表1 2组胰腺癌干细胞表面标志物检测结果

2.4β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响

与NC组比较，ADβ-catenin组胰腺癌干细胞克隆形成能力、成球能力均显著增加（P<0.05），见图4a、b。与NC组比较，ADβ-catenin组胰腺癌干细胞侵袭与迁移细胞数均显著上调（P<0.05），见图4c。ADβ-catenin组细胞在24 h、48 h及72 h的OD值均显著高于NC组（P<0.05），见图4d。另外，与NC组相比，ADβ-catenin组G0/G1期细胞比例显著减少，S期细胞比例增高，差异均有统计学意义（P<0.05），见图4e。NC组细胞凋亡率显著高于ADβ-catenin组（P<0.05），见图4f。

图4β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响

3、讨论

肿瘤组织中存在具有自我更新和多向分化能力的肿瘤干细胞[8,9]。研究证实肿瘤干细胞存在于多种恶性肿瘤中[10,11,12,13]。随着对肿瘤干细胞研究的不断深入，越来越多的研究支持细胞表型为CD24+CD44+ESA+的胰腺癌干细胞与胰腺癌的发生发展、多药耐药性及高侵袭转移性密切相关，CD24+CD44+ESA+胰腺癌干细胞的形成可能是胰腺癌恶性生物学特性产生与维持的关键环节[14,15,16]。

多种信号通路的“串扰”组成了干细胞的调控网络体系，其中Wnt/β-catenin信号通路在动物胚胎的早期发育、器官形成及组织再生等过程中起重要作用，该通路的异常活化或部分成员的基因突变与多种肿瘤的发生发展密切相关[17,18,19,20]。目前，有关经典Wnt信号通路与胰腺癌干细胞的关联研究尚处于起步阶段，相关报道较少，但该通路成员在胰腺癌组织及细胞中的异常表达则已有大量研究证实。Wu等[21]的研究显示，经典Wnt信号通路靶蛋白Wnt1诱导的信号通路蛋白1(Wnt1-inducible signaling pathway protein 1,WISP1）与胰腺导管细胞癌的分化程度、患者的愈合不佳均存在显著的相关性，可能是胰腺癌的潜在危险因素，进一步证实了Wnt信号通路在胰腺癌发生发展中的重要作用。我们在前期研究[22,23]中也采用Affymetrix基因表达谱芯片检测并分析了20例胰腺癌组织及其癌旁组织间的基因表达差异。通过信号通路数据库和实时定量PCR实验的双重筛选，我们得到了6个存在显著差异表达的经典Wnt信号通路主要成员，包括LEF1、MMP7、SFRP5、SOX4、Wnt5A及β-catenin，证实了胰腺癌组织中经典Wnt信号通路的确存在显著的异常活化[22,23]。而β-catenin被认为是经典Wnt信号通路的核心转导环节，其在胞质中的表达水平对于Wnt信号通路维持干细胞池的作用至关重要[24,25]。

为进一步深入探究经典Wnt信号通路在胰腺癌干细胞生物学行为调控中的作用，在后续研究中我们采用流式细胞分选法、免疫磁珠法、侧群细胞分选法、无血清诱导法等多种方法从胰腺癌原代细胞中分选胰腺癌干细胞拟行Wnt信号通路关联研究，但结果均不理想，所获胰腺癌干细胞数量极少，无法满足研究要求。经反复尝试，最终以手术切除胰腺癌组织中分离纯化的胰腺癌原代细胞为对象构建了稳定过表达β-catenin的细胞株，并成功从该细胞株中分选出细胞表型为CD24+CD44+ESA+的胰腺癌干细胞。在此过程中本研究发现，β-catenin过表达载体可有效促进胰腺癌原代细胞生长，并使CD24+及CD24+CD44+ESA+细胞率大幅提高，一方面很好地解决了分选获得的胰腺癌干细胞数量稀少的问题，另一方面也说明经典Wnt信号通路异常活化对胰腺癌细胞的增殖促进作用可能正是通过调控胰腺癌干细胞的生物学行为而实现的。后续细胞生物学行为分析结果也显示，β-catenin过表达胰腺癌干细胞成球能力、克隆形成能力、增殖能力及侵袭迁移能力均较阴性对照组显著增强，证实经典Wnt信号通路在胰腺癌干细胞恶性生物学特性的产生与维持过程中具有重要作用。

本研究初步证实β-catenin对胰腺癌干细胞恶性生物学行为具有维持作用，但因获得样本及胰腺癌干细胞数量极为有限，结果存在较大的局限性，且β-catenin的具体调控机制尚不能明确，还有待大样本量的深入研究进一步证实，但我们相信随着研究的深入，该通路很可能成为突破目前胰腺癌治疗瓶颈的关键。

参考文献:

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基金资助:新疆维吾尔自治区卫生健康青年医学科技人才专项科研项目(WJWY-202340);

文章来源:易超,刘晨,唐津天,等.β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响[J].局解手术学杂志,2024,33(06):486-491.