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基于生物信息学的慢性胰腺炎发病机制探讨

2024-11-29 66 上传者：管理员

摘要：目的：通过生物信息学方法分析慢性胰腺炎转录组表达数据集，探讨其发病的可能机制。方法：利用差异基因分析，明确GSE65146中造模后14d与正常对照组差异基因表达的情况，并对差异基因进行GO及KEGG分析。利用差异基因建立蛋白相互作用网络后选取关键基因进行分析。并利用免疫浸润分析明确慢性胰腺炎模型的免疫浸润情况。结果：慢性胰腺炎模型与对照组共有426个差异基因，其中包括297个上调基因及129个下调基因。GO分析提示差异基因的主要生物学功能富集于趋化作用、伤口愈合、调节肽酶活性、白细胞迁移、蛋白质加工、细胞趋化等生物学过程。KEGG分析提示细胞因子—细胞因子受体相互作用通路可能参与慢性胰腺炎的发生及发展。建立PPI网络后共选取8个关键差异基因(Cd44、Fn1、Ccr2、Ccr5、Tlr4、Ccl3、Fcgr3、Itga2)。免疫浸润分析提示巨噬细胞浸润可能参与了慢性胰腺炎的发病过程。结论：Ccl3、Ccr2及Ccr5作为重要的趋化作用因子，可能通过细胞因子—细胞因子受体相互作用信号通路发挥募集巨噬细胞的作用，从而介导慢性胰腺炎的病理发生过程。

关键词：
GEO数据库
免疫浸润
巨噬细胞
差异基因分析
慢性胰腺炎
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慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是由各种病因导致的胰腺组织进行性的慢性炎症疾病，会改变器官的正常结构和功能[1-2]。它可以表现为先前受伤胰腺的急性炎症发作，或表现为持续疼痛或吸收不良的慢性损伤。与急性胰腺炎的可逆变化不同，慢性胰腺炎的特征是对胰腺造成不可逆的损害。慢性胰腺炎的基本病理特征包括胰腺实质慢性炎症损害和间质纤维化、胰腺实质钙化、胰管扩张及胰管结石等改变[3-4]。临床主要表现为反复发作的上腹部疼痛和胰腺内、外分泌功能不全。饮酒和吸烟是两大主要风险因素，而腹痛是大多数患者的主要症状。诊断主要依靠影像学检查和胰腺功能测试。

流行病学的研究表明，慢性胰腺炎的发病率和患病率在全球范围内总体呈现上升趋势，但自2000年以后，少数发达国家的发病率和患病率趋于平稳或呈下降趋势[5-6]。在中国，慢性胰腺炎的流行病学调查也反映出该疾病与饮酒、吸烟等生活习惯密切相关，同时，遗传因素、营养状态和环境因素也可能影响慢性胰腺炎的发生和发展，但慢性胰腺炎的具体发病机制尚未完全明确[7]。

本研究将利用生物信息学的方法，分析慢性胰腺炎相关的动物模型测序数据，探讨慢性胰腺炎的发病机制，并探索可能治疗方法。

1、资料与方法

1.1 GEO数据库分析

首先从GEO数据库下载GSE65146基因表达数据集，选取该数据中造模后14d的样本，包含3例对照样本和3例慢性胰腺炎样本进行分析，为进一步的研究提供基础数据。基于GPL6246平台的信息构建基因表达矩阵，使用limma软件来检测差异表达的基因。对数据进行预处理，包括通过affy和affyPLM软件包的标准化处理，确保数据质量满足后续分析需求。

1.2数据处理

基于GPL6246平台中构建的信息，通过生物信息学分析，我们成功识别了慢性胰腺炎(CP组)和对照组(Control组)之间的差异表达基因(DEGs),使用limma软件包检测到组间一定数量的基因表达水平有显著差异。差异基因的表达水平通过log2变换进行分析，采用校正后的差异倍数(Foldchange, FC)和P值作为筛选标准，即FC≥2或FC≤-2以及adjustP值<0.05的基因被认为是DEGs。这些DEGs可能是慢性胰腺炎发生发展的关键因素，其表达的变化显示了慢性胰腺炎过程中可能涉及的生物学通路和分子机制。

1.3对差异基因进行GO及KEGG分析

为了进一步理解DEGs在慢性胰腺炎中的功能和参与的生物过程，对这些DEGs进行GO(gene ontology)及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析以揭示基因在生物过程、分子功能和细胞组分中的分布情况，以及这些基因参与的关键信号通路。使用在线工具DAVID对DEGs进行GO分类和KEGG通路富集分析，FDR<0.05的结果被认为具有统计学意义。GO分析表明，DEGs主要富集在特定的生物过程和分子功能中，这提示它们可能在慢性胰腺炎的发病机制中扮演重要角色。KEGG分析揭示了这些DEGs参与的重要代谢和信号通路，为研究慢性胰腺炎的分子机制提供了重要线索。

1.4蛋白互相作用网络(protein-protein interaction, PPI分析)

在GO及KEGG富集分析的基础上，进一步对DEGs进行PPI分析。通过使用STRING数据库检索与DEGs相关的蛋白质互作信息，并利用Cytoscape软件对获得的网络进行可视化展示，得以深入探讨慢性胰腺炎中的蛋白质互作情况。

通过cytoHubba插件对PPI进行权重分析，识别出多个核心蛋白质和关键互作对。这些蛋白质互作关系的揭示不仅有助于揭示慢性胰腺炎分子机制，也可能为疾病的诊断和治疗提供潜在的生物标志物及靶点。

2、结果

2.1差异基因表达情况

以logFC变化≥2或≤-2,且P值<0.05为标准进行DEGs分析。对照组与CP组相比有426个差异表达基因，其中包括297个上调基因及129个下调基因(见图1)。

2.2差异基因GO富集

对上述DEGs行GO分析以明确差异基因聚类情况。如图2所示，在差异基因中，差异表达基因在生物过程注释中，主要富集于趋化作用、伤口愈合、调节肽酶活性、白细胞迁移、蛋白质加工、细胞趋化、白细胞趋化、髓性白细胞迁移、酶原激活等；在细胞成分注释中，它显著富集在含胶原蛋白的细胞外基质、分泌颗粒、细胞的基底部分、顶端质膜、基底质膜、基底外侧质膜、膜筏、膜微结构域、基底膜、血小板α颗粒等；在分子功能注释中，主要参与内肽酶活性、丝氨酸类内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、糖胺聚糖结合、肽酶调节剂活性、免疫受体活性、细胞外基质结构成分、水解酶活性等分子功能(见图2)。

图1对照组与CP组DEGs分析

图2上调基因GO分析结果

2.3差异基因进行KEGG富集

差异基因共涉及30条信号通路，按涉及基因数排序，包括胰腺分泌、细胞因子—细胞因子受体相互作用、神经活性配体与受体的相互作用、补体和凝血级联、蛋白质消化与吸收、结核病、吞噬体、癌症中的蛋白聚糖、金黄色葡萄球菌感染、病灶黏附、ECM与受体的相互作用、溶酶体、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、肾素—血管紧张素系统、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、氨基酸的生物合成等信号通路(见图3)。

图3差异基因进行KEGG富集

2.4 PPI构建及权重分析

将426个差异表达基因输入到STRING数据库中，然后用Cytoscape软件进行分析。利用MCC、MNC、Degree、EPC、Closeness、Radiality模块对参与PPI构建的基因进行权重分析，得到权重排名前8的基因(Cd44、Fn1、Ccr2、Ccr5、Tlr4、Ccl3、Fcgr3、Itga2)。其中，8个关键基因中共有3个基因参与了细胞因子—细胞因子受体相互作用通路，即Ccl3、Ccr2及Ccr5。见图4。

2.5免疫浸润分析

利用免疫浸润比较对照组及CP组中免疫细胞的占比。Tregs存在确实，故只分析22种免疫细胞。其中对照组在调节T细胞激活及NK细胞激活中有统计学差异(P<0.05)。在M1型巨噬细胞浸润的比较中，CP组的M1型巨噬细胞浸润高于对照组，但无统计学差异(P>0.05)。见图5。

图4PPI分析结果

图5对照组及CP组免疫浸润结果

3、讨论

慢性胰腺炎是一种长期的炎症性疾病，导致胰腺功能逐渐丧失，可能引起胰腺纤维化、胰岛细胞损伤和胰腺外分泌功能障碍。目前慢性胰腺炎的具体病理机制尚不明确，有研究认为慢性胰腺炎与胰蛋白酶活性相关。胰蛋白酶在胰腺内过早激活可诱发胰腺炎[1]。人类阳离子胰蛋白酶(PRSS1)的突变可引起遗传性胰腺炎，这种遗传性胰腺炎的渗透率不完全，并且作为散发性慢性胰腺炎的风险因素。遗传性胰腺炎遵循常染色体显性遗传模式，90%的受影响家庭携带PRSS1 p.R122H、p.R122C或p.N29I位点突变。上述突变可导致胰蛋白酶自我激活的可能性增加和降解效果减弱。另有研究认为内质网应激在胰腺炎中发挥重要作用。在散发的慢性胰腺炎病例中发现几种罕见突变会导致蛋白质错误折叠、分泌阻塞、保留，并最终导致内质网应激。在慢性胰腺炎中导致蛋白质错误折叠和内质网应激的变异基因包括PRSS1、CPA1(羧肽酶A1)和CEL(羧酯脂肪酶);CEL可导致2型糖尿病患者胰腺外分泌不足。还有研究表明囊性纤维化跨膜传导调节器(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因的杂合子变异与慢性胰腺炎(在没有囊性纤维化的情况下)之间存在关联[8]。CFTR是胰腺导管中碳酸氢盐分泌的主要调节器。CFTR功能的失调导致啮齿类动物实验性胰腺炎。酒精和烟草烟雾都会导致小鼠和人类的CFTR功能障碍，这解释了与酒精或吸烟相关的慢性胰腺炎患者中突变的患病率增加。乙醇诱导微循环紊乱和胰腺缺血，这导致胰腺腺泡细胞损伤、炎症级联的激活以及坏死性炎症反应，结果引发纤维化和慢性疾病。动物研究表明，激活的巨噬细胞在疾病早期抵消了中性粒细胞的促炎症免疫信号，促进了愈合过程。

根据本研究中GO分析及KEGG分析的结果提示，细胞因子—细胞因子受体相互作用可能主要参与了慢性胰腺炎的发生。8个关键基因中共有3个基因参与了该通路，即Ccl3、Ccr2及Ccr5。Ccl3也被称为巨噬细胞炎症蛋白1α(Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha, MIP-1α),是一种属于CC类趋化因子家族的细胞因子。作为一种小分子的趋化因子，Ccl3在免疫系统中发挥着重要的作用，特别是在调节白细胞(尤其是巨噬细胞和T细胞)的迁移和活化方面。Ccl3能够吸引免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞和T细胞，到炎症或感染的部位。这通过Ccl3与这些细胞表面的特定受体(如Ccr1和Ccr5)的结合来实现，促进细胞的趋化和活化[9-10]。Ccl3在免疫应答中扮演着调节者的角色，通过招募由于Ccl3在炎症反应中的关键作用，它成为研究各种炎症性疾病的一个重要标靶。

Ccr2基因是一种编码趋化因子受体的基因，主要与免疫系统中的单核细胞和巨噬细胞的迁移和定位有关。Ccr2基因编码的受体主要结合单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),在炎症反应中起关键作用。它能够调控单核细胞从血液向炎症部位的迁移，并在多种免疫和炎症疾病中发挥重要作用。Ccr5是一种G蛋白偶联受体(GPCR),在许多免疫细胞类型上表达，包括T细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。Ccr5主要的功能是作为某些趋化因子的受体，参与调控免疫细胞的迁移和活动。通过与其配体(如Ccl3、Ccl4和Ccl5等CC类趋化因子)结合，Ccr5在免疫应答、炎症反应以及HIV感染中发挥重要作用。Ccr5通过与其配体结合，促进免疫细胞向炎症或感染部位的迁移，参与局部的免疫和炎症反应[11-12]。Ccr5及其配体在多种炎症性疾病中的作用也是研究的焦点，包括自身免疫性疾病、慢性炎症等。通过调节Ccr5的活性可能为这些疾病提供新的治疗策略。已有研究表明，巨噬细胞在趋化因子作用下可浸润于胰腺，并导致胰腺炎的发生与发展[13]。本研究的免疫浸润分析提示，CP组M1型巨噬细胞的浸润高于Control组，尽管差异无统计学意义，但CP组M1型巨噬细胞明显上调，若增加纳入的样本量，则可能获得有统计学意义的结果。笔者推测包括Ccl3、Ccr2及Ccr5作为重要的趋化作用因子，可能通过细胞因子—细胞因子受体相互作用信号通路发挥募集巨噬细胞的作用，从而介导慢性胰腺炎的病理发生过程。

本研究中尚存在不足，主要为样本量较小，故在部分结果分析中，可能存在分析不全的情况。在进一步的研究中，我们考虑再增加实验造模及对照组样本量，并考虑进行胰腺mRNA的表达谱测试，以进一步明确本研究中的结论。

文章来源:曾华火,黄晓磊,王佳玮,等.基于生物信息学的慢性胰腺炎发病机制探讨研究[J].医学理论与实践,2024,37(22):3781-3784.