糖尿病肾病(DN)由大约40%的糖尿病患者发展而来，并随着世界范围内糖尿病患病率的急剧上升而逐年增加，DN症状包括肾小球滤过率下降、白蛋白尿及终末期肾衰竭等，然而大多数患者在需要进行肾脏替代治疗之前便死于心血管并发症及感染[1,2]。引起DN的致病因素很多，包括家族遗传、血糖代谢异常、高血压及肥胖等[3],目前对DN的治疗方式主要集中在通过药物控制血糖、血压及血脂代谢上，但这些治疗方法仅可延缓DN的进展，不能取得十分令人满意的效果。因此推动针对病理机制的特异性治疗的发展十分有必要[4]。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚的主要成分之一，因其抗炎、抗氧化及降血糖的作用而广受关注[5]。目前的研究已证实，EGCG在DN动物模型中具有肾脏保护作用[6],然而对其机制的研究甚少。本研究通过链脲佐菌素(STZ)诱导DN模型，旨在探讨EGCG在DN中发挥肾脏保护作用可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

8周龄雄性清洁级ICR小鼠110只，体质量(22.4±1.3)g,购自河北省实验动物中心[许可证号：SCXK(冀)2018-004],并由邢台医学高等专科学校动物中心实验室饲养，于通风良好的笼具中，恒温恒湿，12 h昼夜交替适应性喂养1 w,这期间水和食物正常获取。

1.2材料与试剂

EGCG(上海融禾医药科技发展有限公司),二甲双胍(Metformin,湖北康迪斯化工有限公司),STZ(北京沃凯生物科技有限公司),NOD样受体热蛋白结构域(NLRP)3抑制剂MCC950(美国Selleck公司),胰岛素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(德国Sigma公司),尿蛋白、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)定量试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),8-羟基脱氧鸟苷(OHdG)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、IL-18 ELISA检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司),苏木素-伊红(HE)染液，末端脱氧核苷酸转移酶接到dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),NLRP3、胱天蛋白酶(Caspase)-1、cleaved Caspase-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、β-肌动蛋白(actin)一抗、辣根过氧化物酶标记二抗(武汉博士德生物技术有限公司)。

1.3实验仪器

One Touch Horizon血糖仪(美国强生公司),XSP-9CA光学显微镜(上海光学仪器厂),蛋白电泳仪(Mini-PROTEAN Tetra,美国Bio-rad公司),UVmini-1285分光光度计(日本岛津公司),Microfuge低温高速离心机(美国贝克曼公司),超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司),电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),CFX960 Touch实时荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)。

1.4动物模型建立及分组处理方法

将小鼠随机分为对照(Control)组、DN组、Metformin组、EGCG 50、100、200 mg/kg组各10只，除Control组腹腔注射给予等体积生理盐水，其余各组腹腔注射给予200 mg/kg STZ,16 w之后除DN组每日皮下注射给予等体积生理盐水，其余各组按照分组命名分别每日皮下注射给予100 mg/kg Metformin或对应剂量的EGCG,第17周开始收集24 h尿液及血样用于后续检测。此外另设DN+EGCG组、DN+MCC950组、DN+MCC950+EGCG组各10只，其中DN+EGCG组和DN+MCC950+EGCG组按前述EGCG 200 mg/kg组的方式给予EGCG处理，DN+MCC950组和DN+MCC950+EGCG组在16 w之后每日腹腔注射给予10 mg/kg的MCC950,其余各组腹腔注射给予等体积生理盐水，持续1 w,所有实验操作符合动物伦理委员会的要求。

1.5 24 h尿白蛋白检测

17 w时将小鼠放入代谢笼，自由饮水，收集24 h尿液，4℃2 000 r/min离心10 min,按照试剂盒提供的操作说明分别检测尿液中白蛋白及8-OHdG水平。

1.6肾脏损伤标志物及炎症细胞因子检测

各组小鼠尾静脉取血，3 000 r/min离心20 min,取上清，按照试剂盒提供的操作说明，检测各组小鼠血液中Scr、BUN、MCP-1、IL-6、IL-1β及IL-18水平。

1.7口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

各组小鼠空腹过夜16 h,尾静脉取血，血糖仪检测空腹血糖水平，按照试剂盒提供的操作说明检测空腹胰岛素水平，灌胃法给予1 g/kg葡萄糖，尾静脉取血检测灌胃后15、30、60、90、120 min时的血糖水平。

1.8肾脏组织获取及SOD检测

将收集血样及尿样的小鼠脱颈法处死，磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗，取肾脏组织，部分用于组织切片染色，另一部分组织在4℃的PBS中匀浆充分，3 000 r/min离心20 min,收集上清。按照试剂盒提供的操作说明检测组织中SOD含量。

1.9 HE染色检测病理变化

取大鼠肾脏组织于4%多聚甲醛固定24 h,流水冲洗，通过70%～100%的乙醇进行梯度脱水30 min,二甲苯透明，石蜡包埋后切片，HE染色，光学显微镜观察肾组织病理改变。并采用Paller法[7]对肾小管损伤情况进行半定量评分。

1.10 TUNEL染色检测肾脏组织细胞凋亡

对肾脏组织石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡处理，按照TUNEL试剂盒的操作说明进行染色封片，光学显微镜观察肾脏组织中的细胞凋亡，每张切片选择6个视野计数凋亡细胞在总细胞数中的百分比。

1.11 Western印迹检测蛋白表达

RIPA裂解液对各组肾脏组织总蛋白进行提取，二喹啉甲酸(BCA)法定量总蛋白量，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离各组蛋白，半干转膜法将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h,弃残余的液体，一抗4℃条件下孵育过夜，TBST缓冲液清洗，二抗孵育2 h,电化学发光(ECL)显色液显影，凝胶成像仪扫描灰度值进行相对定量。

1.12统计学分析

采用SPSS19.0软件进行方差分析，两两比较采用Tukey检验。

2、结 果

2.1各组体质量、空腹血糖、血浆胰岛素水平比较

DN组4、8、12、16 w体质量、空腹胰岛素水平较Control组明显降低，空腹血糖水平较Control组明显升高(P<0.01);DN组、Metformin组、EGCG 50、100、200 mg/kg组体质量无明显差异(P>0.05);与DN组比较，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg空腹血糖水平明显降低，空腹胰岛素水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.2 EGCG增强DN模型小鼠血糖清除能力

与Control比较，DN组注射葡萄糖后各时间段的血糖水平明显升高(P<0.01);与DN组比较，Metformin组，EGCG 100、200 mg/kg组各时间段血糖水平明显降低(P<0.01)。见表2。

2.3 EGCG降低DN模型小鼠肾脏损伤标志物水平

与Control组比较，DN组24 h尿液中白蛋白、血清Scr和BUN水平均明显升高(P<0.01);与DN组相比，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg组24 h尿白蛋白、血清Scr和BUN水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表3。

2.4 EGCG减轻DN模型小鼠肾脏组织病理变化

Control组肾组织结构清晰，形态正常，肾小管细胞排列整齐；DN模型组肾小球体积增加，基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀，肾间质有明显的纤维增生，且肾损伤评分较Control组明显升高(P<0.01);Metformin组、EGCG 200 mg/kg组上述病理变化均明显减轻，且肾损伤评分较DN组明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表3、图1。

与Control组比较：1)P<0.01;与DN组比较：2)P<0.05,3)P<0.01;表2、3、4同

表1各组体质量、空腹血糖、血浆胰岛素水平比较

表2各组血糖水平比较

2.5 EGCG减少DN模型小鼠肾脏组织细胞凋亡

与Control组[(4.66±1.05)%]比较，DN组肾脏组织中凋亡细胞百分比明显增多[(43.81±5.36)%,P<0.01];与DN组相比，Metformin组，EGCG 100、200 mg/kg组肾脏组织中凋亡细胞百分比明显减少[(12.36±2.46)%、(29.65±3.14)%、(17.48±2.83)%;P<0.05,P<0.01]。见图2。与Control组比较，DN组肾脏组织中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01);与DN组相比，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg组肾脏组织中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.01)。见表3、图3。

表3各组尿白蛋白和血清肾损伤标志物水平、肾脏组织病理变化、细胞凋亡调控蛋白表达

2.6 EGCG抑制NLRP3通路激活

与Control组比较，DN组小鼠肾脏NLRP3和Caspase-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与DN组比较，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg组肾脏NLRP3和Caspase-1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。见图4、表4。

2.7 EGCG降低DN模型小鼠肾脏组织氧化应激

与Control组比较，DN组尿液中8-OHdG水平明显升高，SOD水平明显降低(P<0.01);与DN组相比，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg组尿液中8-OHdG水平明显降低，肾脏组织SOD水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表4。

图1各组肾脏组织病理(HE染色，×400)

图2 EGCG对肾脏组织细胞凋亡的影响(TUNEL染色，×200)

图3 Western印迹检测各组肾脏组织凋亡调控蛋白表达

2.8 EGCG减轻DN模型小鼠肾脏炎症细胞因子水平

与Control组比较，DN组血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-18水平明显升高(P<0.01);与DN组相比，Metformin组、EGCG 100、200 mg/kg组血清MCP-1、IL-6、IL-1β和IL-18水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表4。

图4 EGCG对各组肾脏组织NLRP3通路激活的影响

表4各组8-OHdG、SOD、炎症细胞因子水平、NLRP3通路蛋白表达比较

2.9 MCC950对EGCG治疗DN的影响

与Control组比较，DN组肾脏中NLRP3、Caspase-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与DN组相比，DN+EGCG组、DN+MCC950组肾脏NLRP3、Caspase-1蛋白表达明显降低(P<0.01);与DN+EGCG组相比，DN+MCC950+EGCG组肾脏NLRP3、Caspase-1蛋白表达明显降低(P<0.05)。DN组较Control组24 h尿白蛋白、血清Scr和BUN水平明显升高(P<0.01);与DN组相比，DN+EGCG和DN+MCC950组24 h尿白蛋白、血清Scr和BUN水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与DN+EGCG组相比，DN+MCC950+EGCG组24 h尿白蛋白、血清Scr和BUN水平明显降低(P<0.01)。见表5、图5。

与Control组比较：1)P<0.01;与DN组比较：2)P<0.05,3)P<0.01;与DN+EGGG组比较：4)P<0.05,5)P<0.01

表5各组NLRP3、Caspase-1蛋白表达及肾脏损伤标志物水平比较

图5各组NLRP3、Caspase-1蛋白表达

3、讨 论

DN是糖尿病患者最主要的合并疾病之一，首先表现为慢性微血管病变，并进而引起肾脏结构和功能损伤，如不及时治疗，将造成肾功能不全及肾功能衰竭等严重后果[8]。引起DN的具体发病机制尚不清楚，目前比较公认的观点认为，高血糖是引起包括肾脏血流动力学障碍、炎症反应、氧化应激等一系列异常的主要诱因[9]。茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，诸多研究表明其具有抗炎、抗氧化、抑菌及抗肿瘤等作用[10]。儿茶素是茶多酚的一类成员，是一种天然的多酚类物质，EGCG是儿茶素的主要异构体之一，在DN中，EGCG可通过其抗炎和抗氧化特性，发挥肾脏保护作用[11,12]。然而EGCG作用的具体分子机制，目前的研究尚有很大的空白。本研究参照Tesch等[13]经典方法使用STZ诱导了DN小鼠模型，发现模型小鼠的体质量相比对照组减轻，与前人通过该方法建立模型的结果一致。本研究结果证实了EGCG对小鼠DN的调节作用。

氧化应激与炎症反应在DN发生发展过程中起着重要作用，糖尿病患者体内长期处于高血糖作用下，引起体内活性氧自由基过量产生而造成抗氧化系统失衡，使得生物膜脂质过氧化，并进一步导致细胞内蛋白变性及DNA损伤[14],而高糖状态下葡萄糖可与细胞内组分发生一系列生化反应，诱导IL-6、IL-1、TNF-α等炎症细胞因子表达，引发炎症反应对肾脏产生损害[15]。在本研究检测的氧化应激指标中，8-OHdG是活性氧自由基攻击DNA分子产生的一种氧化物，可反映DNA的氧化损伤，SOD是体内清除活性氧自由基的重要酶类，在抗氧化平衡失调时SOD被大量消耗[16,17]。本研究对炎症细胞因子MCP-1、IL-6、IL-1β及IL-18水平进行了检测，发现模型小鼠相比于对照小鼠均发生上调，经过EGCG治疗过后，以上变化均发生扭转。MCP-1具有诱导血液中的单核细胞聚集于病变部位发挥生物学作用，IL-6、IL-1β和IL-18是炎症的重要调控因子，也被报道在DN中起着关键作用[18]。上述结果表明，EGCG有效减轻了DN小鼠体内的氧化应激和炎症反应。

糖尿病患者循环系统和肾脏组织持续的微炎症状态是发展为DN的病理生理基础，微炎症状态的本质是固有免疫反应，是DN发生发展的核心[19]。NOD样受体家族(NLRs)模式识别受体是固有免疫系统的其中一种类型，可受病原体入侵或细胞损伤后释放的多种具有免疫调节活性的细胞内分子激活，NLRP3为NLRs中的一员，当其激活后，在细胞内组装构成NLRP3炎性小体，激活并释放Caspase-1、IL-1β和IL-18,同时免疫细胞的激活诱导免疫应答失衡与肾小球足细胞的氧化应激和凋亡紧密相关[20,21]。相关研究报道，炎症小体NLRP3参与多种肾脏疾病的发生发展，如DN、肾脏纤维化、足细胞损伤[22]。且有研究指出NLRP3在糖尿病肾病中起着主要的调控作用，Wu等[23]研究发现通过托珠单抗阻断IL-6受体，可抑制NLRP3炎症小体激活，从而发挥对糖尿病肾损伤的保护作用。Han等[24]研究发现，DN患者肾脏中线粒体ROS水平升高，继而激活NLRP3炎性体，促使炎症因子的产生。本研究表明，炎症小体的过度激活与DN的发生有关，与上述研究一致。本研究结果表明，MCC950+EGCG联用对DN的调节作用具有更明显的效果，可能是因为EGCG除了对NLRP3的调控作用之外，还存在对其他途径的调控作用。

综上，EGCG可降低DN小鼠空腹血糖水平，并相应地提高空腹胰岛素水平和血糖清除能力，同时EGCG可减轻肾脏损伤及病理变化，减少肾脏细胞凋亡，抑制氧化应激和炎症反应，其调节作用其中一部分机制是通过对NLRP3通路的抑制作用实现的，然后本研究仅证实了EGCG对DN发挥的保护作用与NLRP3的联系，可能还存在其他调控途径有待后续研究进一步探索。

参考文献:

8孔五宝,李华君,王晓蕴,等.硝苯地平控释片联合沙库巴曲缬沙坦对2型糖尿病肾病合并高血压患者疗效及内皮功能的影响[J].解放军医药杂志,2021;33(2):51-5.

10苏琴,张宪,刘红升,等.茶多酚辅助治疗蝮蛇咬伤的临床观察[J].临床误诊误治,2018;31(4):60-4.

11杨秀红,李亚秋,冯聪聪,等.EGCG对糖尿病小鼠肾脏保护作用的实验观察[J].中华医学杂志,2016;96(17):1330-5.

基金资助:邢台市科技计划项目(2020ZC101);

文章来源:张献彩,刘子宸,王艳盛,等.EGCG对小鼠糖尿病肾病的影响及对NLRP3通路的调控作用[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4306-4311.