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维立西呱对缺氧诱导的HL-1细胞纤维化的作用机制研究

2025-07-16 109 上传者：管理员

摘要：目的：探讨维立西呱对缺氧诱导的HL-1小鼠心房肌细胞纤维化的影响及机制研究。方法：在不同时间（0、12、24、48 h）和不同浓度的维立西呱（0、5、10、20、50μmol/L）的条件下，将HL-1细胞置于细胞缺氧箱进行造模，蛋白印迹检测纤维化蛋白I型胶原蛋白（CollagenⅠ）、Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）、ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）表达水平。模型建立成功后，将HL-1细胞分为对照组、缺氧组和缺氧+维立西呱组，蛋白印迹检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、ɑ-SMA蛋白以及可溶性鸟苷酸环化酶（s GC）-环磷酸鸟苷（cGMP）-蛋白激酶G1(PKG1)信号通路中可溶性鸟苷酸环化酶1/ɑ3(GUCY1A3)、PKG1、血管扩张剂刺激磷蛋白（VASP）和磷酸化VASP(p-VASP)蛋白表达水平。结果：与缺氧0 h相比，缺氧12 h时HL-1细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、ɑ-SMA蛋白表达水平最高（t=0.8312,P>0.05;t=3.102,P<0.05;t=6.403,P<0.05）。在缺氧12 h条件下，与维立西呱浓度0μmol/L相比，维立西呱浓度为50μmol/L时，CollagenⅠ、CollagenⅢ、ɑ-SMA蛋白表达明显下降（t=14.10、6.440、9.264，均P<0.05）。与对照组相比，缺氧组CollagenⅠ、CollagenⅢ、ɑ-SMA蛋白表达均明显升高（t=4.648、6.643、4.551，均P<0.05）。与缺氧组相比，缺氧+维立西呱组CollagenⅠ、CollagenⅢ、ɑ-SMA蛋白表达均明显降低（t=4.717、4.771、3.367，均P<0.05）。与对照组相比，缺氧组GUCY1A3、PKG1、p-VASP蛋白表达均明显下降（t=16.56、8.492、7.430，均P<0.05）。与缺氧组相比，缺氧+维立西呱组GUCY1A3、PKG1、p-VASP蛋白表达均明显升高（t=5.876、3.006、4.637，均P<0.05）。3组比较，VASP蛋白表达无显著差异（F=0.5671,P>0.05）。结论：维立西呱可以减轻缺氧诱导的HL-1细胞的纤维化，sGC-cGMP-PKG1信号通路可能参与其中并发挥作用。

关键词：
HL-1细胞
心律失常
心房颤动
纤维化
维立西呱
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心房颤动(AF)是指心房的不规则跳动,是临床最常见的心律失常类型[1]｡AF的病理生理学机制十分复杂,涉及多种因素之间的动态相互作用,包括心房重构､炎症､自主神经功能失衡等[2]｡心房纤维化常见于AF､心力衰竭､心脏瓣膜疾病､高血压等心血管疾病[3],其中与AF关系最为密切｡心房纤维化是AF的重要病理基础,而AF是心房纤维化的临床表现之一[4]｡心房纤维化的过程是指心房细胞间质出现异常胶原纤维的沉积,主要由Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)及Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)组成｡α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)同时具有成纤维细胞和肌细胞的特性,参与心肌纤维化过程｡

维立西呱是可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)激动剂,通过一氧化氮(NO)-sGC-环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路发挥作用｡NO-sGC-cGMP信号通路介导许多不同的生理功能,其中NO驱动的cGMP作为第二信使,具有细胞保护和抗动脉粥样硬化作用,包括扩张血管､抑制血管平滑肌细胞增殖､阻断白细胞募集和抗血小板活性等｡维立西呱可直接刺激sGC,也可通过增加sGC对NO的敏感性来刺激sGC,使cGMP产生增加,确保即便在NO浓度偏低或氧化应激条件下,cGMP的生成也能得到保障[5],cGMP已成为一种新的心肺疾病治疗靶点｡维立西呱用于治疗射血分数减低的心力衰竭(HFrEF)[6],可以改善心力衰竭患者的心脏重塑｡然而,维立西呱对心房纤维化的影响仍有待研究｡本研究通过缺氧的方式建立HL-1细胞纤维化模型,探索维立西呱对HL-1细胞纤维化模型的作用机制｡

1、材料与方法

1.1实验仪器与设备细胞室超净工作台购自苏州净化设备有限公司;CO2细胞培养箱购自美国ThermoScientific公司;倒置光学显微镜购自上海三目光学仪器厂;恒温水浴箱购自杭州蓝天化验仪器厂;低速台式离心机购自湖南湘仪离心机有限公司;小型台式离心机购自北京市六一仪器厂;细胞缺氧箱购自上海川纳实验仪器有限公司;-80℃超低温电冰箱购自日本SANYO公司;电泳系统､电转膜系统均购自美国Bio-Rad公司｡

1.2实验试剂HL-1细胞､10%胎牛血清､去甲肾上腺素､L-谷氨酰胺､多聚赖氨酸均购自广州赛库生物公司;维立西呱､DSMO､PEG300､Tween-80均购自MedChemExpress公司;Claycomb培养基､纤维结合蛋白均购自英国Sigma-Aldrich公司;1×PBS溶液､20×TBST均购自北京索莱宝公司;Anti-βactin抗体､Anti-GUCY1A3抗体､Anti-VASP抗体均购自武汉三鹰生物公司;Anti-CollagenⅠ抗体､An-ti-CollagenⅢ抗体､Anti-ɑ-SMA抗体､Anti-p-VASP抗体均购自美国Abcam公司;Anti-PKG1抗体购自美国CellSignalingTechnology公司;通用二抗溶液购自美国PROMEGA公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;甲醇购自天津永晟精细化工有限公司｡

1.3HL-1细胞纤维化模型的建立体外培养HL1小鼠心房肌细胞系,使用Claycomb培养基,所有培养基均含有100μmol/L去甲肾上腺素､10%胎牛血清､4mmol/LL-谷氨酰胺,于37℃含5%CO2细胞培养箱中进行培养｡将HL-1细胞置于37℃含5%CO2､5%O2细胞缺氧箱进行0､12､24､48h缺氧,检测纤维化蛋白CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达水平,确定HL-1细胞最佳缺氧时间｡使用不同浓度0､5､10､20､50μmol/L的维立西呱刺激HL-1细胞,后进行缺氧12h,检测CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达水平,确定维立西呱最佳干预浓度,建立HL-1细胞纤维化模型｡

1.4蛋白印迹实验根据1.3中已确定的模型建立条件,将HL-1细胞分为3组:对照组､缺氧组､缺氧+维立西呱组｡对照组于细胞培养箱中正常培养12h;缺氧组于细胞缺氧箱内缺氧12h;缺氧+维立西呱组用浓度50μmol/L的维立西呱刺激后于细胞缺氧箱内缺氧12h｡检测CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达水平以及sGC-cGMP-PKG1信号通路中GUCY1A3､PKG1､VASP和p-VASP蛋白表达水平｡提取各组HL-1细胞的总蛋白,按照BCA蛋白检测试剂盒的说明书测定蛋白浓度｡将蛋白Marker及3组样品(10μg蛋白)依次加入SDS-PAGE凝胶槽中,设置电压150V进行电泳40~60min,直到目标蛋白显著分离｡电泳结束,用200mA的恒定电流进行转膜2h｡然后用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭PVDF膜1h｡PVDF膜用1×TBST清洗5min×3次,加入一抗(鼠抗β-actin抗体1∶5000,兔抗Colla-genⅠ抗体1∶500,兔抗CollagenⅢ抗体1∶500,兔抗ɑ-SMA抗体1∶2000,兔抗GUCY1A3抗体1∶2000,兔抗PKG1抗体1∶2000,兔抗VASP抗体1∶1000,兔抗p-VASP抗体1∶1000),置入4°C的冰箱摇床过夜｡转天,回收一抗,1×TBST清洗5min×3次,加入二抗(鼠二抗1∶5000,兔二抗1∶5000),室温孵育1h｡弃去二抗,1×TBST清洗5min×3次,曝光显影,保存照片｡采用ImageJ(version:1.53)软件计算各个蛋白条带的灰度值｡其中,目的蛋白的相对光密度值代表其与内参β-actin的灰度值的比值｡

1.5统计学处理统计分析与图像绘制应用GraphPadPrism8.2.1软件进行｡数据符合正态分布,两组样本均数比较使用t检验,多组样本均数比较使用单因素方差分析onewayANOVA,P<0.05表示差异具有统计学意义｡

2、结果

2.1缺氧不同时间HL-1细胞纤维化蛋白表达与缺氧0h相比,缺氧12h时HL-1细胞CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达最高(t=0.8312,P>0.05;t=3.102,P<0.05;t=6.403,P<0.05),纤维化程度最重,确定最佳缺氧时间为12h,见图1｡

图1缺氧不同时间HL-1细胞纤维化蛋白表达水平比较

2.2不同浓度维立西呱刺激HL-1细胞的结果在缺氧12h条件下,与维立西呱浓度0μmol/L相比,维立西呱浓度为50μmol/L刺激HL-1细胞时,CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达出现明显下降(t=14.10､6.440､9.264,均P<0.05),改善纤维化作用显著,确定维立西呱干预HL-1细胞纤维化的最佳浓度是50μmol/L,见图2｡

图2不同浓度维立西呱刺激HL-1细胞后纤维化蛋白表达水平比较

2.3HL-1细胞纤维化蛋白表达结果如图3所示,与对照组相比,缺氧组CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达水平均明显升高(t=4.648､6.643､4.551,均P<0.05)｡与缺氧组相比,缺氧+维立西呱组CollagenⅠ､CollagenⅢ､ɑ-SMA蛋白表达均明显降低(t=4.717､4.771､3.367,均P<0.05)｡

2.4HL-1细胞sGC-cGMP-PKG1信号通路蛋白表达结果如图4所示,与对照组相比,缺氧组GUCY1A3､PKG1､p-VASP蛋白表达水平均明显下降(t=16.56､8.492､7.430,均P<0.05)｡与缺氧组相比,缺氧+维立西呱组GUCY1A3､PKG1､p-VASP蛋白表达水平均明显升高(t=5.876､3.006､4.637,均P<0.05)｡3组比较,VASP蛋白表达无显著差异(F=0.5671,P>0.05)｡

图3HL-1细胞纤维化蛋白表达水平比较

图4HL-1细胞sGC-cGMP-PKG1信号通路蛋白表达水平比较

3、讨论

AF是心内科常遇的心律失常之一,可增加心力衰竭､栓塞､卒中和猝死的风险,是因心律失常而住院的主要原因,也与不良预后息息相关[7]｡心房重构是AF的重要发生机制,特征表现为心房肌细胞增生,成纤维细胞转换为肌成纤维细胞,蛋白沉积,细胞间质纤维化,导致心房解剖结构改变,折返环路形成,维持房颤的持续发生[8]｡

维立西呱作为治疗慢性心力衰竭的新型药物已批准上市,应用于临床｡在动物实验方面,维立西呱表现出多重作用,在改善心肌肥厚､心脏纤维化､高血压､冠状动脉供血､肾脏功能等方面均发挥重要作用｡研究发现,维立西呱在高血压诱导的终末器官损伤模型中可改善血压升高､心肌肥厚情况,提高大鼠存活率,可使肾损伤分子Kim-1和骨桥蛋白表达显著降低,对肾脏有保护作用[9]｡此外有研究发现,维立西呱可改善心肌梗死后的心功能不全,减少梗死面积,减轻心肌梗死诱导的左心室纤维化和心肌细胞凋亡[10]｡然而,维立西呱对AF的影响仍有待研究｡有研究显示,在心房快速起搏方式构建的兔AF模型中,维立西呱能够减轻心房的电重构和结构重构,逆转扩大的心房,显著降低心肌纤维化,使心房有效不应期缩短[11],提示维立西呱可能是治疗AF的一种新药物｡

HL-1细胞系是小鼠心房肌细胞系,最初是由美国Claycomb等建立的细胞系,从患有心房肌肿瘤的AT-1小鼠中发现并分离出来,具有独特的能力,它有正常心肌的形态学､生物化学和电生理学特性,可以连续传代､自主收缩[12]｡研究证实HL-1细胞参与AF早期电及结构重构[13]｡心房纤维化是AF结构重构的标志,反过来也成为AF持续性存在的基础[14],两者互为因果｡研究显示,心房肌纤维化常开始于AF的早期阶段,对心房结构产生不可逆的微观变化,随病情的进展向表型转化,促进AF的发生及维持[15]｡

本研究通过细胞缺氧箱成功构建HL-1细胞纤维化模型｡HL-1细胞在缺氧12h时纤维化蛋白表达水平最高,出现显著的纤维化改变,提示缺氧可诱导HL-1细胞出现纤维化改变｡在缺氧12h条件下,随着维立西呱浓度的增加,纤维化蛋白表达水平有下降趋势,在浓度为50μmol/L时下降最明显,对纤维化表现出显著的改善作用,提示维立西呱对HL-1细胞纤维化模型的改善作用可能与药物浓度有关｡

有研究应用高频刺激的方式建立快速起搏AF细胞模型,发现维立西呱可以减轻HL-1细胞AF模型的结构重构和电重构[11],与本研究具有部分相似性,均提示维立西呱有减轻HL-1细胞纤维化的作用,但造模方式不同｡本研究通过缺氧方式建立细胞模型,将HL-1细胞分为3组,可以观察到缺氧组CollagenⅠ､CollagenⅢ和ɑ-SMA蛋白表达均升高,出现显著的纤维化改变,缺氧+维立西呱组纤维化改变明显减轻｡

NO-sGC-cGMP信号通路在多种心血管疾病或非心血管疾病中均发挥重要作用｡cGMP与多个下游靶标结合并激活,如cGMP调节的离子通道､cGMP调节的磷酸二酯酶,最重要的是cGMP调节的PKG,包括PKG1和PKG2[16]｡研究发现sGCcGMP-PKG信号通路在糖尿病心肌病､系统性硬化症等多种与纤维化相关的疾病中发挥作用[17-18]｡本研究中,缺氧后HL-1细胞的GUCY1A3､PKG1及反映PKG1活性的p-VASP蛋白表达均降低,而维立西呱干预逆转了上述改变｡以上结果证明,在细胞层面,在缺氧诱导的HL-1细胞纤维化模型中,缺氧可导致sGC-cGMP-PKG1信号通路受损,经维立西呱干预后,该信号通路有所恢复｡所以推测在维立西呱改善缺氧诱导的HL-1细胞纤维化的过程中,sGC-cGMP-PKG1信号通路可能参与其中并发挥作用｡然而,目前关于维立西呱改善心房纤维化的研究尚处于初级阶段,但此过程中是否涉及其他常见的纤维化信号通路或炎症因子､氧化应激路径等,还需后续深入研究,延伸到动物及人体研究,以期为AF的治疗提供新思路｡

参考文献:

[3]王燕,许纲,程立君,等.心房纤维化研究进展[J].心血管病学进展,2019,40(3):389-392.

[6]石曈,黄淑.维利西呱及其抗心力衰竭的研究进展[J].心血管病学进展,2023,44(5):394-397.

[9]肖滢.可溶性鸟苷酸环化酶激动剂Vericiguat靶向调控AMPK/mTOR及自噬通路抑制病理性心肌肥厚的机制研究[D].北京协和医学院,2021.

[13]孙丽萍,周沫,徐文静.HL-1细胞培养及房颤细胞模型的建立[J].现代生物医学进展,2014(36):7011-7014.

基金资助:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK-029A); 天津市教委科研计划项目(2021KJ226);

文章来源:陈晓琳,高怡,李虹敏,等.维立西呱对缺氧诱导的HL-1细胞纤维化的作用机制研究[J].天津医科大学学报,2025,31(04):329-333.