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大鼠肺炎支原体肺炎应用双黄连颗粒对TNF-α、IL-6和NF-κB的影响分析
摘要：目的:研究双黄连颗粒对肺炎支原体感染大鼠血清或肺组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和核因子(NF)-κB等炎性相关因子的影响，进一步研究双黄连颗粒的药理作用机制。方法:制备大鼠肺炎支原体肺炎模型，60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组和双黄连低、中、高剂量组及阳性药对照组六组，在连续感染3d后开始给药。连续给药7d后采集大鼠血清及肺组织样本，肺组织经HE染色后于光学显微镜下观察病变情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测血清中TNF-α、IL-6水平;Westernblot检测肺组织中磷酸化NF-κBp65的表达。结果:空白对照组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平分别为(0.96±0.23)ng/mL、(451.43±33.42)ng/mL，磷酸化NF-κBp65相对含量为0.16±0.05;模型组大鼠肺组织病理评分为(4.50±1.32)分，血清中TNF-α、IL-6的水平分别为(1.84±0.42)ng/mL、(603.29±63.57)ng/mL，磷酸化NF-κBp65相对含量为1.07±0.06，与空白对照组相比均升高。双黄连低、中、高剂量组血清TNF-α水平分别为(1.62±0.32)ng/mL、(1.47±0.31)ng/mL、(1.24±0.25)ng/mL，血清IL-6水平分别为(551.56±50.93)ng/mL、(509.57±49.92)ng/mL、(487.14±44.15)ng/mL，磷酸化NF-κBp65相对含量分别为0.43±0.15、0.12±0.07、0.10±0.05，与模型组相比均呈剂量依赖性下降。结论:双黄连颗粒能够通过降低TNF-α、IL-6水平，抑制NF-κB信号通路异常活化，从而减轻肺组织中的炎性症状，从而使肺组织恢复正常的形态和生理功能。
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肺炎支原体是引起呼吸道感染常见的病原体，其引起的肺炎支原体肺炎约占肺炎的30%[1]。据报道，MPP占非细菌性肺炎的1/3以上，常见于5～19岁的儿童及青少年。MP经空气飞沫传播，与咳嗽及密切接触有关[2]。MP无细胞壁结构，对主要作用于细胞壁的抗生素不敏感，目前临床上主要应用阿奇霉素等大环内酯类抗生素对MPP进行治疗。但是大环内酯类抗生素长期使用不良反应较大，长期反复使用易出现耐药性[3,4]。
双黄连由金银花、黄芩、连翘三味中药组成，具有疏风解表、清热解毒的功效。临床研究表明，双黄连对小儿MPP有较好的临床疗效，常作为辅助药物联合阿奇霉素治疗MPP[5]。本研究通过采用MP感染大鼠建立MPP模型，比较给药前后大鼠肺组织病理变化及血清中炎症因子的水平，从而观察双黄连颗粒对大鼠MPP的治疗效果，并探讨其可能的抗炎机制。
1、材料
1.1实验动物
雌、雄性SD大鼠各30只，体质量180～220g,SPF级，购于扬州大学比较医学中心[许可证号SCXK(苏)2017-0001]。
1.2药品及试剂
肺炎支原体国际标准株ATCC15531FH，购于美国菌种保藏中心;双黄连颗粒(哈药集团中药二厂，批号180601);阿奇霉素片(辉瑞制药有限公司，批号C14202031135);肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购于南京翼飞雪生物科技有限公司;核因子(NF)-κBp65抗体、磷酸化NF-κBp65抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购于沈阳万类生物科技有限公司。
1.3实验仪器
Bio-tek全自动酶标仪ELx800(美国Bio-tek仪器有限公司);TG-16W型台式离心机(长沙湘仪离心机有限公司);Mettler-ToledoXS204电子天平(瑞士梅特勒-托利多国际有限公司)。
2、方法
2.1肺炎支原体肺炎动物模型的建立及给药方案
60只SD大鼠按随机数表法分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为空白对照组、模型组、阳性药对照组和双黄连低、中、高剂量组。大鼠适应性饲养1周后，用4%水合氯醛麻醉，空白对照组大鼠以100μL无菌生理盐水滴鼻，其余各组大鼠以MP菌液(约5×106个/mL)缓慢经鼻腔滴入气管支气管，连续3d。感染后第2天开始灌胃给药，空白对照组和模型组给予等体积生理盐水;阳性药对照组给予阿奇霉素30mg/kg(对应人体剂量约5mg/kg)，双黄连低、中、高剂量组分别给予双黄连颗粒0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg(对应人体剂量分别为0.1g/kg、0.2g/kg、0.4g/kg)，每日灌胃1次，连续7d。
2.2肺组织样本的采集及处理
给药结束后第2天处理动物，采用4%水合氯醛麻醉大鼠后，腹主动脉取血，离心取上清液置-80℃冰箱冻存，用于细胞因子的检测。解剖取出肺组织，称重并计算肺系数。取左下叶肺组织固定于福尔马林溶液中，用于HE染色;取右下叶肺组织匀浆，用于蛋白检测。
2.3HE染色
取福尔马林固定的肺组织，水洗10～20min，乙醇梯度脱水后，用二甲苯透明，放入石蜡中包埋并切片(4～6μm)，于40～45℃水中展平，贴于洁净载玻片上，在60～65℃恒温箱内烘片15～30min，进行HE染色，在显微镜下进行病理学检查。
2.4大鼠血清中TNF-α、IL-6水平测定
按照ELISA试剂盒所附说明书依法测定。
2.5大鼠肺组织中NF-κBp65蛋白检测
按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书提取并测定蛋白浓度，相同蛋白含量加入预制的10%SDS-PAGE凝胶上，电泳分离后转印到PVDF膜上。转印好的PVDF膜置入10%脱脂牛奶中室温封闭2h，用TBST洗净后加入一抗稀释液，4℃孵育过夜，用TBST洗净后加入二抗稀释液，室温摇床上孵育2h。然后用化学发光液显色，在暗房中反应30s～2min后进行显影操作，得到显影胶片。将胶片拍照后采用Image-ProPlus6.0软件对条带进行光密度分析。
2.6统计学方法
应用GraphPadPrism5.0软件进行数据分析，每组统计个数≥3，计量资料以±s表示，使用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行组间显著性差异检验，P<0.05为差异有统计学意义。
3、结果
3.1大鼠肺系数变化
根据肺系数计算公式:肺系数(mg/g)=肺质量(mg)/体质量(g)，得出各组大鼠肺系数。结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠肺系数增加(P<0.05);各给药组及阳性药对照组与模型组相比，肺系数有不同程度下降，其中双黄连中、高剂量组及阳性药对照组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表16组大鼠肺系数比较
3.2大鼠肺组织病理变化情况
大鼠肺组织HE染色结果如图1、表2所示。空白对照组大鼠肺组织结构清晰完整，肺泡壁薄，肺泡腔内未见充血、炎症细胞浸润，支气管壁完整，管腔内无细胞脱落;模型组大鼠肺组织内可见明显炎症，肺泡壁明显增厚，并有细胞脱落，气管支气管周围、管腔内以及肺泡腔内有明显炎性细胞浸润，部分有红细胞渗入现象。与模型组比较，阳性药对照组大鼠肺组织病变情况减轻，炎性细胞浸润减少，病理评分下降;双黄连各组大鼠肺组织病变也明显改善，并呈一定的量效关系，其中双黄连中剂量组改善情况与阳性药对照组相当。
图1大鼠肺组织HE染色切片(×200)
表2大鼠肺组织病理评分
3.3大鼠血清中TNF-α及IL-6水平测定
与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05);与模型组比较，各给药组TNF-α、IL-6水平均有不同程度下调，其中阳性药对照组及双黄连中、高剂量组对IL-6下调作用显著(P<0.05)，而阳性药对照组及双黄连高剂量组能下调TNF-α的水平(P<0.05)。阳性药对照组对TNF-α、IL-6的下调作用介于双黄连中、高剂量之间。见表3。
表3不同组大鼠血清中TNF-α及IL-6水平的变化
3.4大鼠肺组织中磷酸化NF-κBp65蛋白水平的变化
与空白对照组比较，模型组中磷酸化NF-κBp65水平升高(P<0.05);与模型组比较，双黄连各剂量组均能降低磷酸化NF-κBp65水平(P<0.05)，并呈一定的剂量依赖性;阳性药对照组与模型组比较，磷酸化NF-κBp65水平下降(P<0.05)，效果介于双黄连低、中剂量之间。见表4。
表4大鼠肺组织磷酸化NF-κBp65相对表达量的变化
4、讨论
MP引发的肺部感染发病率高，常见于儿童青少年，临床上常采用阿奇霉素等大环内酯类抗生素治疗。研究表明，阿奇霉素能够缩短MPP患儿的咳嗽时间和住院时间[6,7]。然而，由于抗生素的滥用，MP的耐药性也逐渐增强，导致单纯使用抗生素的治疗效果越来越差[8,9,10]。而中药治疗MPP具有药效缓慢持久、标本兼治的特点，因此中西医结合治疗为临床治疗MPP提供了新的思路。
MPP在中医上属于“喘嗽”的范畴，治疗时应以清热解毒、养阴益肺、宣肺解表为主[11,12]。双黄连由金银花、黄芩、连翘等三味中药组成，方中黄芩清热燥湿、凉血解毒;金银花清热解毒、疏散风热;连翘消肿散结、疏散风热。全方具有清热解毒、疏风解表的功效。有研究表明，双黄连能显著改善患儿上呼吸道感染导致的发热、鼻塞、流涕、咽充血等症状，治愈率高达80%[13,14];与西药合用治疗小儿MPP，能明显降低炎性因子水平，提高患儿免疫力，减少反复感染的发生及耐药菌株的出现[15,16,17,18,19]。
本研究表明，双黄连各剂量组均能够明显减轻MP感染引起的大鼠肺组织炎症，使肺泡结构趋于正常，炎性细胞浸润逐渐减轻，病理损伤得到修复。有研究[20,21]表明，MP在侵入机体后，可刺激免疫细胞过量产生IL-6、TNF-α等炎性因子，引起疾病的产生及炎症的加重。TNF-α属于炎性介质，可对炎症反应中的生理病理过程进行干预介导，进而导致局部炎症反应，造成局部组织或器官的损伤[22];IL-6参与体液免疫的调节及肺部炎症反应的病理过程，其水平高低可反映肺部感染程度，还可促进TNF-α等炎性因子的产生而加重炎性损伤[23,24]。本研究结果表明，双黄连颗粒能够剂量依赖性地降低大鼠血清中IL-6和TNF-α水平，从而减轻肺组织的进一步损伤，使其得以修复。
TNF-α等细胞因子的过度表达能引起NF-κB信号通路的活化[25]。NF-κB信号通路广泛参与机体炎症、细胞增殖、氧化应激、细胞凋亡等过程。已有研究证实，NF-κB信号通路与MPP密切相关，NF-κB信号通路的激活能够进一步刺激TNF-α等炎症因子的过表达[26,27,28]。本研究发现，在模型组大鼠肺组织中，磷酸化NF-κBp65的表达量明显增加，而双黄连颗粒能抑制这种失调反应，提示双黄连颗粒可通过抑制NF-κB信号通路的异常活化发挥抗炎作用。
综上所述，双黄连能够下调IL-6和TNF-α等炎症因子水平，抑制肺组织NF-κB信号通路过度表达，进而减轻肺部炎症，使肺组织逐渐恢复正常形态和生理功能。然而，双黄连发挥抗炎作用的具体药理机制，还有待进一步研究。
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