钩藤作为传统中药在中国已有悠久的使用历史，为茜草科钩藤属[1]。钩藤具有清热平肝、息风定惊的功效，主要用于治疗癫痫及头痛眩晕等症[2]。钩藤中主要的活性成分为吲哚类生物碱，约占钩藤含量的0.2%，而在这些生物碱中以钩藤碱含量最高，占28%～50%，其余生物碱还包括去氢钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱等[3,4]。现代中药药理学研究表明，钩藤碱主要作用于中枢神经系统和心血管系统，有抗焦虑、镇静、降压及保护脑缺血等作用[5,6,7,8]，具有广阔的开发前景。

人结肠癌上皮细胞（thehumancolonadenocarcinomacellline,Caco-2）单层模型中，培养成熟的细胞可形成细胞极性和致密单层。Caco-2细胞单层模型的结构和功能与机体小肠上皮细胞十分相近，还有微绒毛、紧密连接等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的转运体和酶系[9]。完全分化的Caco-2细胞单层已经被广泛地确定为一种可以使用的体外模型，经常用来评价药物的跨膜吸收、胞旁转运及受体介导的转运[10,11]。

为了对钩藤碱作进一步的开发，本实验首次采用液相色谱-质谱法对钩藤碱在Caco-2细胞上的转运特性进行研究。

1、材料

1.1药物与试剂

钩藤碱（纯度98.0%，批号ST07840120）：上海诗丹德生物科技有限公司；胎牛清（fetalbovineserum,FBS）：美国Gibco公司；维拉帕米（批号HY-A0064）、普萘洛尔（批号HY-B0573):MCE中国公司；乙腈（批号10965929833）、甲醇（批号109993335909）：德国Merck公司。

1.2主要仪器

Agilent1200高效液相色谱仪、SPD型紫外检测器：美国安捷伦科技有限公司；XS205DU型十万分之一电子天平：德国MettlerToledo公司；KQ-300DB数控超声仪：江苏省昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司。

2、方法

2.1Caco-2细胞模型的建立

按照文献[12]方法建立Caco-2细胞模型。采用DMEM培养基（含10%FBS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺以及1%青链霉素）于37℃、5%CO2条件下进行培养。当细胞密度达到80%时，加入0.25%胰酶-EDTA消化，调整Caco-2细胞密度为5×104/mL。将细胞接种在Transwell小室进行生长，细胞刷状缘侧（apical,AP）加容积为0.4mL的悬浮液，细胞基底侧（basolateral,BL）加入0.6mL培养液，在第1周内，隔天换液，从第2周开始，每日换液，在第21天时，即可进行相关转运实验。在这一过程中测定跨上皮电阻值（transepithelialelectricalresistance,TEER）。观测Caco-2细胞形态学变化，测定Caco-2细胞单层TEER值以及肠刷状缘细胞标志酶———碱性磷酸酶的活性，建立并验证Caco-2细胞模型。

2.2细胞毒性实验

取对数生长的Caco-2细胞，设置为每孔1000个细胞，放入96孔板中进行培养，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育。培养24h后，使用Hank平衡盐溶液（Hanksbalancedsaltsolution,HBSS）润洗细胞，加入不同剂量的药物，每个剂量设置3个复孔，培养4h。结束孵育后，每孔加入CCK810μL，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2h，在酶标仪上测定吸光度，其测定吸收波长为490nm。实验中另设不加细胞的空白对照组，以及只加细胞不加任何药物样品溶液的阴性对照组。根据测得的吸光度，计算细胞存活率。

2.3钩藤碱溶液的配制

精密称取3.56mg的钩藤碱样品于1.5mLEP管中，之后添加185.2μLDMSO溶剂溶解，涡旋3min,1000r/min离心3min，配置成浓度50mmol/L的储存液，溶液中DMSO浓度低于0.1%,-20℃保存。实验操作当日，从50mmol/L中取10μL，加入10μL100%DMSO，然后用HBSS稀释成500、250、125、62.5、31.25、15.63μmol/L钩藤碱溶液。

2.4分析样品处理

精密量取钩藤碱跨膜转运液100μL，加甲醇900μL稀释，超声5min,12000r/min离心5min，取上清液。

2.5液相色谱-质谱分析

2.5.1液相色谱条件

WatersSB-C18色谱柱（2.1mm×50mm,1.8μm），流动相乙腈（A)-0.1%甲酸（B）梯度洗脱（0～2min,15%～15%A;2～5min,15%～50%A;5～5.1min,50%～90%A;5.1～6.5min,90%～90%A;6.5～7min;90%～15%A;7～9min,15%～15%A）；运行时间：9min；流速：0.4mL/min；进样量：1μL；柱温：4℃。

2.5.2质谱检测参数

电喷雾电离（ESI源），正离子模式，多反应检测扫描，离子源温度500℃，离子化电压5000V，雾化气（GS1)345kPa，辅助气（GS2)345kPa，用于定量分析的化合物为钩藤碱检测离子对，m/z为385.21→178.1。

2.6药物转运实验

用HBSS缓冲液将培养21d的Caco-2单层细胞膜冲洗3次，最后1次在37℃培养箱中平衡20min。(1)AP→BL侧的转运。将各浓度的钩藤碱溶液0.4mL加到细胞AP侧作为供给池，同时BL侧加入空白的HBSS溶液0.6mL作为接受池。(2)BL→AP侧的转运。将各浓度的钩藤碱溶液0.6mL加到BL侧作为供给池，同时AP侧加入空白HBSS溶液0.4mL作为接受池。置于37℃、55r/min的恒温摇床上孵育，分别于载药后30、60、90、120min于接收液侧采样100μL，同时补加相同容积HBSS缓冲液，每组平行3个孔，计算钩藤碱在Caco-2细胞单层累积转运量（ΔQ）及表观渗透系数（apparentpermeabilitycoefficient,Papp）。(3)P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）抑制剂（维拉帕米）对转运的影响。抑制剂溶液与药物溶液采用HBSS溶液同时进行配制，其中钩藤碱浓度为125mol/L，抑制剂溶液浓度为200μmol/L。然后分别加入到AP侧（0.4mL）和BL侧（0.6mL），分别在30、60、90、120min于接受池取样100μL，并加入100μL空白HBSS溶液补足液体。样品于-40℃条件下保存。

Papp大小反映药物透过单层细胞的能力以及药物吸收的速度、程度。它可由以下公式计算：

（公式）

式中Papp的计量单位是cm/s;Q是累积转运量，代表化合物在接收端出现的总量，计量单位是μmol；ΔQ/Δt是接受端药物出现的速率（ΔQ为Δt内的转运量），计量单位是μmol/s;c0是化合物在供给端的初始浓度，计量单位是mmol/L;A是聚碳酯膜的表面积，计量单位是cm2。

2.7统计学方法

每组实验重复3次，取平均值。采用“均数±标准差（x±s）”对数据进行统计学描述，采用多因素方差分析对均数的差异进行比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1Caco-2细胞模型的建立和验证

依照正常细胞的培养顺序培养Caco-2细胞单层，细胞生长状态良好，培养第3周后，在显微镜下观察细胞生长速度较为均匀，边界十分明显，细胞之间出现很好的连接状态。选择种板后第3、6、9、12、15、18、20、21天测量电阻值。Caco-2细胞单层的完整程度使用TEER进行测评，通常高于500Ω·cm2就能够看做单层致密较为完整[13]。至第21天，TEER值升至（984.45±55.15）Ω·cm2。在第3周时，两侧碱性磷酸酶活力达到5.10±0.07，通过AP与BL比值看出，碱性磷酸酶在AP侧的活性显著高于BL侧，即产生了极化现象[13]。15d后趋势变缓，AP侧与BL侧细胞分化明显，达到转运实验的需求。

3.2细胞毒性实验

125μmol/L钩藤碱处理Caco-2细胞24h后，细胞存活率为95%，说明钩藤碱对Caco-2细胞无明显杀伤作用。因此本实验采用31.25、62.5、125μmol/L钩藤碱溶液进行转运研究。

3.3方法学研究

3.3.1标准曲线的建立

选取钩藤碱对照品，精密测量，放置在容积为25mL容量瓶内，用甲醇溶解，定容至刻度，配置成浓度为1000、500、200、100、50ng/mL的溶液，取10μL进样，依照“2.5”项下色谱条件进行测定。以钩藤碱浓度（ρ）对峰面积（A）进行线性回归，得标准曲线的回归方程：A=2360.13271ρ+3.48856×105(r=0.99959），线性范围为57.816～1156.32ng/mL，线性关系良好。

3.3.2精密度考察

测定钩藤碱高、中、低3种不同浓度的对照品溶液，日内精密度为2.12%～4.21%；日间精密度为2.74%～5.66%，均小于15%，符合生物样品检测要求。

3.3.3回收率试验

取钩藤碱对照品溶液，使用甲醇稀释成浓度为1000、400、100ng/mL的对照品溶液，在设定好的色谱条件下进行检测，并代入标准曲线计算出钩藤碱浓度。以检测浓度与配制浓度之间的比例，计算回收率。钩藤碱方法低浓度（115.632ng/mL）的回收率为100.71%±7.05%，中浓度（462.528ng/mL）的回收率为104.34%±3.32%，高浓度（1156.32ng/mL）的回收率为106.21%±2.05%，均满足生物样本分析要求。用乙腈配制浓度分别为115.632、462.528、1156.32ng/mL的钩藤碱溶液，记为Set1；空白HBSS溶液经过前处理后，配制浓度为115.632、462.528、1156.32ng/mL的钩藤碱溶液，记为Set2；含有钩藤碱浓度分别为115.632、462.528、1156.32ng/mL的HBSS溶液，经过前处理后，得到钩藤碱溶液，记为Set3。提取回收率采用Set3/Set2进行计算，基质效应采用Set2/Set1进行计算。结果显示，低、中、高浓度组样品的提取回收率分别为98.21%、97.28%、95.46%，而基质效应分别为94.5%、93.7%、95.4%，并且前1min不进色谱系统，对本实验无影响。结果均满足生物样本测定的条件。

3.3.4稳定性考察

使用400ng/mL钩藤碱对照品溶液，在0h进样分析后，分别于第1、2、4、6、12、24小时进行测定，计算各时间点待测成分峰面积回收率及峰面积RSD，每次进样1L，钩藤碱峰面积RSD<15%，表明样品在24h内稳定。同时对低、中、高浓度组样品的室温稳定性（25℃保存24h）、长期稳定性（-40℃保存1个月）及反复3次冻融（-40℃）进行了考察，结果均显示RSD<15%。符合生物样品检测要求。

3.3.5定量限考察

采用逐级稀释法，测定其钩藤碱定量限为2ng(S/N=10.3）。

3.3.6专属性考察

依照“2.5”项下色谱条件进行测定，得到色谱图（见图1）。结果表明，空白甲醇溶液、含有钩藤碱的Caco-2细胞转运液、钩藤碱对照品、加有盐酸维拉帕米和钩藤碱的Caco-2细胞转运液的检测结果均无干扰，表明本方法的专属性良好。

图1钩藤碱在Caco-2细胞模型上的高效液相色谱图

3.4转运方向、时间和浓度对钩藤碱转运的影响

转运方向、钩藤碱浓度、转运时间对钩藤碱转运量的影响见表1。采用SPSS19.0软件进行三因素一元定量资料的方差分析，分析结果见表2。结果表明转运方向、钩藤碱浓度及转运时间对钩藤碱转运的影响具有统计学意义（P<0.05）。组间比较显示，随着时间的延长，转运量逐渐趋于饱和，其中从30min到60min，转运量差异不具有统计学意义（P>0.05），而从60min到120min时，转运量差异具有统计学意义（P<0.05）；随着浓度的增加，转运量增加，其中从31.25μmol/L至125μmol/L浓度，转运量差异有统计学意义（P<0.05），说明随着浓度的升高，转运量逐渐趋于饱和。从表3可知，钩藤碱从BL侧到AP侧的外排速率明显高于从AP侧到BL侧的吸收速率。

表1不同浓度、不同孵育时间及不同给药部位下钩藤碱转运量

表2钩藤碱浓度、孵育时间及给药部位对钩藤碱转运量影响的三因素方差分析结果

表3不同浓度及转运方向状态下钩藤碱的Papp值

3.5蛋白抑制剂对钩藤碱转运的影响

钩藤碱(125μmol/L）跨膜转运的Papp(BL→AP）显著高于Papp(AP→BL）值，且外流比为2.040，说明钩藤碱主要以主动转运的方式跨膜吸收，且外排转运体可能参与药物在Caco-2细胞的转运。当P-gp抑制剂维拉帕米（100μmol/L）与钩藤碱（125μmol/L）共存时，钩藤碱转运量的变化见表4。当加入P-gp抑制剂之后，药物由BL侧向AP侧的转运量显著减少，而由AP侧到BL侧的转运量显著增加，说明P-gp参与了药物的外排作用。对上述数据进行两因素方差分析（见表5），结果显示P-gp抑制剂维拉帕米对钩藤碱转运的影响具有统计学意义（P<0.05）。这表明P-gp参与了药物在Caco-2细胞中的吸收转运。加入抑制剂后，钩藤碱的Papp见表6。

表4蛋白酶抑制剂维拉帕米、孵育时间、给药部位对钩藤碱转运量的影响

表5孵育时间及转运方向对钩藤碱转运量影响的两因素方差分析结果

3.6阳性对照药普萘洛尔和阿替洛尔的转运

在本实验环境下，Caco-2细胞单层模型中呈良好吸收转运的阳性对照药普萘洛尔的Papp为（2.69±0.43）×10-5cm/s，吸收良好，呈难转运的阳性对照药阿替洛尔的Papp值为（2.58±0.14）×10-7cm/s，与文献[14,15]的结果一致。钩藤碱在31.25、62.5、125μmol/L浓度下Papp为10-6cm/s。

表6蛋白抑制剂对钩藤碱Papp的影响

4、讨论

对钩藤中钩藤碱及其他系列生物碱含量测定时，色谱条件的选择可以使用内标法和外标法。预实验发现对照品质谱响应和待分析物差异较大，且稳定性也欠佳，对照品和内标物的分离度不理想，故采用外标法。

转运蛋白在Caco-2细胞膜上，可以探究载体所提供的药物摄取以及排泄机制。Caco-2细胞所表达的P-gp[16]、多药耐药蛋白-2(multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)[17]和乳腺癌耐药蛋白（breastcancerresistanceprotein,BCRP)[18]浓度和正常人体空肠所表现出来的浓度一致[19]。除此之外，在Caco-2细胞顶膜中也有所表达，这也证实了在Caco-2细胞系中的极化表达[20]。

确立快速准确的检测分析手段是确保该实验可以如期完成的前提条件。本实验运用高效液相色谱法检测Caco-2细胞模型HBSS液中钩藤碱，出峰时间达到了4.25min，无显著的Caco-2模型内溶液干扰。钩藤碱在57.816～1156.32ng/mL范围内，其标准曲线方程的线性关系良好，回收率达到90%以上，日内以及日间RSD均小于6%，并且在温度为（37±1）℃的实验条件下稳定，满足样品实验的需要。这一检测手段具有灵敏度高、检测速度快的优势。

钩藤碱（31.25、62.5、125μmol/L）在Caco-2细胞双向转运中的Papp(BL→AP）/Papp(AP→BL）值均大于1.5[21,22]，说明钩藤碱的转运规律中有外排蛋白的参与。在ATP结合盒转运蛋白家族中，P-gp、MRP2、BCRP是被研究最深入的几种外排转运蛋白[23]。通常情况下，口服药物需要经过小肠这一器官代谢达到血液以及组织中，上述所提到的转运蛋白具有屏障作用，能够将药物外排入肠腔。

在Caco-2细胞模型中，经常运用Papp来测评药物口服吸收的程度。目前以Papp评价药物吸收程度的标准[24]:Papp<1×10-6cm/s，吸收率为0～20%，难吸收；10-6cm/s<Papp<10-5cm/s，吸收率为20%～70%，吸收中等；Papp>10-5cm/s，吸收率为70%～100%，吸收良好。因此，钩藤碱的吸收良好，可以开发成口服制剂，值得进行深入研究。通过设定不同时间点（0、30、60、90、120min）的研究发现，钩藤碱的转运量随着时间的增加而增加，于60min时吸收显著增强，Papp(BL→AP）均显著高于Papp(AP→BL）。此外，不同浓度（31.25、62.5、125μmol/L）钩藤碱的双向转运程度随浓度升高而增加，且Papp(BL→AP）显著高于Papp(AP→BL），说明药物在吸收过程中以主动转运为主，且一定有外排蛋白的参与。P-gp蛋白抑制剂维拉帕米可显著降低钩藤碱从BL侧至AP侧的Papp值，增加从AP侧至BL侧的Papp值，钩藤碱的转运规律中有外排蛋白的参与，提示钩藤碱为外排转运蛋白P-gp的底物。

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