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稳心颗粒在心功能障碍大鼠中的作用效果研究

2023-11-01 83 上传者：管理员

摘要：目的建立不同浓度脂多糖模拟ALI/ARDS大鼠心功能障碍模型，基于miR-106-b25、miR-93调控的内质网应激-线粒体复合膜稳态机制，检测相关蛋白，研究稳心颗粒改善ALI/ARDS相关心功能障碍机制，为临床应用提供依据。方法选取60只SD大鼠(200～250g),随机平均分为A/B 2组(n=30),A/B 2组大鼠再应用随机数字表法分为未服药A0～A4五组，喂服稳心颗粒B0～B4五组；在所有大鼠气管内滴入不同浓度LPS,12h后建立不同损伤程度的ALI/ARDS模型；观察A/B组2组ALI/ARDS模型大鼠的呼吸频率、脉氧饱和度、心率、血压；分别测定A组建模后12h、B组服药四周后指标。结果心肌细胞在ALI/ARDS病理状态下激发ERS,介导UPR激活，通过调控内质网钙通道释放蛋白，依赖MAMs平台稳态维持正常转运机制，而这一过程又受多种miRNA调控，一旦超过细胞调节能力，过度应激，大量Ca2+转运至线粒体导致线粒体钙超载，细胞肿胀，最终导致细胞凋亡，从而使心肌细胞严重受损。结论稳心颗粒改善ALI/ARDS相关心功能障碍大鼠的有效性。

关键词：
动物模型
心功能障碍
急性呼吸窘迫综合征
急性肺损伤
稳心颗粒
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目前国内外对急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)相关心功能障碍机制研究不多，对心功能障碍的治疗也多为对症处理，缺乏整体辩证施治方法[1]。而对于心功能障碍的诊断目前还是使用传统的二维超声心动图，通过测量心腔大小，室壁厚度，根据计算值算出射血分数，评估心功能状态，这种普通二维彩超存在着切面影响大，可重复性差，不能诊断早期心功能下降缺点[2]。除此之外，对于心肌细胞整体功能测定，当前常用方法还是放射核素心肌灌注显像(myocardial perfusion imaging, MPI),它需要依赖201TlCl、99Tcm-MIBI和131I-BMIPP之一作为心肌灌注显像示踪剂，采用单光子发射计算机断层显像(Single-PhotonEmissionComputedTomography, SPECT)现最终存活心肌结果[3],存在空间分辨率低、放射核素剂量大、成像时间较长，易受衰减影响缺点。这些都表明临床需要提供一种新的治疗方法，治疗药物来针对这一病症。除SARS-CoV-2致病因素外，ALI/ARDS也常继发于脓毒症、肺炎、胃内容物吸入或重大创伤后，以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤为主要病理特征，临床表现为急性呼吸窘迫和难治性低氧血症，常伴有多器官功能衰竭[4],通常在初期表现为急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI),初始阶段只出现轻度的呼吸功能下降，但如不早期干预，最终会进展为ARDS[5]。据报告美国每年大约有15万人最终进展为ARDS,死亡率为40%～50%,因此对于ALI/ARDS相关的心功能障碍机制研究是当前临床急需，也为稳心颗粒的可能作用靶基因提供了方向。稳心颗粒对miRNA调控作用尚未明确，对于可能的miR-106b-25、miR-93调控机制，可以采用荧光探针定量PCR法，测量稳心颗粒治疗前后的miRNA水平进行验证[6]。为此，本研究建立不同浓度脂多糖模拟ALI/ARDS大鼠心功能障碍模型，基于miR-106-b25、miR-93调控的内质网应激-线粒体复合膜稳态机制，检测相关蛋白，研究稳心颗粒改善ALI/ARDS相关心功能障碍机制，现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

60只健康成年SD大鼠(Sprague-Dawley rats, SD) (200-250g)应用随机数字表法分为A/B 2组，每组各30只大鼠。

1.2建模及用药

(1)A组为模型组。

模型制备前禁食水12h; 75%酒精消毒实验器材和实验台，腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉，使其75度仰卧固定于大鼠操作台上，颈部外置光源，左手轻轻将大鼠舌头向外拉出，即可见大鼠声门随呼吸开闭；将20号套管针剪短针芯后经口插入气管，拔出针芯确定套管在气管内后，滴注按目标剂量配制好的LPS溶液，迅速使大鼠立位旋转，使LPS溶液在两肺中均匀分布，拔出套管；待大鼠清醒后，在清洁级动物实验室常规喂养12h。

(2)B组为模型+用药组。

将30只SD大鼠再分为0.9%生理盐水(normal saline, NS)+2.7g/kg稳心颗粒对照组(B0组)、LPS 5mg/kg+2.7g/kg稳心颗粒组(B1组)、LPS 10mg/kg+2.7g/kg稳心颗粒组(B2组)、LPS 15mg/kg+2.7g/kg稳心颗粒组(B3组)、LPS 20mg/kg+2.7g/kg稳心颗粒组(B4组)(n=6)。自由摄食和饮水。按以上方法建立肺损伤模型，12h后，B组大鼠给予2.7g/kg稳心颗粒水溶液灌胃给药，灌胃体积为5mL/kg,每日给药1次，持续4周。

1.3指标及检测方法

荧光探针定量PCR法测量心肌细胞miR-106b-25和miR-93表达水平：

第一步：提取A组每只大鼠心肌组织miRNA

将大鼠心肌组织从液氮中取出，加入氯仿，无水乙醇，离心，所得的液体为RNA,将RNA样品用核酸紫外分光光度进行浓度测定，准备反转录。

第二步：反转录

配制反转录液，离心后，轻柔混匀，放在冰上待用。使用TaqMan microRNA探针，加入miR-106b-25和miR-93的特异性引物序列。

第三步：荧光定量PCR反应

设置引物浓度，退火温度，测试引物，进行PCR反应，B组4周后进行。

1.4统计学方法

所有数据均采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以x¯±s表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，计数资料以百分率(%)表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2组大鼠用药前后miR-106-b25、miR-93水平比较

用药前，2组大鼠miR-106-b25、miR-93水平差异不显著，P>0.05;用药后，B组模型+用药组miR-106-b25、miR-93水平均显著优于A组模型组，差异显著，P<0.05,见表1。

表1 2组大鼠用药前后miR-106-b25、miR-93水平比较

3、讨论

越来越多的证据表明内质网应激与ALI/ARDS的发病机制有关。同时，内质网应激在心肌肥大和心力衰竭的发展中也发挥着关键作用。而内质网跨膜相关蛋白又受多种miRNA调控，miRNA其自身虽然不能编码蛋白质，但能在转录后调控靶基因mRNA的表达，从而发挥生物学功能。在临床上，我们试用了中药稳心颗粒治疗存在心功能障碍患者[7],取得一定疗效，但其作用机理未明确。已知稳心颗粒可以调节Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)防止心力衰竭[4]。也有报道证实稳心颗粒对心肌梗死的治疗和心律失常的防治具有确切临床疗效，同时还证实其具有益气活血养阴作用。

稳心颗粒是一个优良的心血管类药方[8,9],其主要由党参、三七、甘松等组成，现代药理研究表明，党参有效成分在心血管系统疾病的治疗中发挥着非常重要的作用，能够抑制钙内流和细胞凋亡。而三七具有促血管生成，抑制细胞凋亡，减轻氧化应激，抑制炎性反应和内皮依赖性血管舒张作用，同时甘松挥发油可抑制氧化应激诱导的细胞死亡。有研究表明用三七总皂苷(panax notoginsenoside, PNS)处理的缺血再灌注损伤细胞中miR-30c-5p的水平显著上调。而党参能使老化模型大鼠282lncRNAs、283mRNAs和19miRNAs上调，这证明了党参的抗衰老作用[10]。这些各组分的研究一定程度揭示了稳心颗粒分子层面可能机制。但是，众所周知中药方剂讲究君臣佐使，往往多组分配伍使用。

本次研究结果显示，用药前，2组小鼠miR-106-b25、miR-93水平差异不显著，P>0.05;用药后，B组模型+用药组miR-106-b25、miR-93水平均显著优于A组模型组，差异显著，P<0.05。提示，稳心颗粒能明显改善心功能障碍大鼠miR-106-b25、miR-93水平，效果显著。

综上所述，稳心颗粒在心功能障碍大鼠中具有较优的作用效果，且有助于miR-106-b25、miR-93基因表达水平的改善。

参考文献:

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[4]郭力,赵丽云,赵福建稳心颗粒对缺血性心律失常大鼠微小RNA.1及其调控蛋白表达的影响[J].中华中医药杂志,2014.29(7):4.

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[6]吕梦,纪晓迪,刘珂珂,等稳心颗粒对心肌梗死大鼠BCL-2/BAX/Caspase凋亡途径基因表达的影响[J] .海南医学院学报, 2022 ,28(7):493-498,506.

[7]戎成振,卢家忠,吕新才,等.稳心颗粒联合尼可地尔对STEMI病人行急诊PCI术后室性心律失常的影响[J]蚌埠医学院学报,2022 ,47(12)-:1673-1677.

[8]年土艳,骣脂联素及其受体基因多态性与冠心病相关性研究进展[J]云南医药, 2022,39(06)-.541-544.

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[10]杨成会.优质护理应用于冠心病心绞痛患者80例分析[J]云南医药,2022, 43(6):110-112.

基金资助:福建省中青年教师教育科研项目(科技类)(JAT200211);

文章来源:吴炜清,杨代和.稳心颗粒在心功能障碍大鼠中的作用效果研究[J].云南医药,2023,44(05):92-94.