多肽在内分泌、免疫、神经系统等生命活动中发挥了重要作用，目前已有上百种多肽药物获批上市，被广泛用于抗肿瘤、抗病毒、降糖等领域[1,2]。同时，多肽药物因活性高、剂量小、毒副作用少等优点，已成为新药研发的热点之一[3]。尽管多肽药物安全性较高，但仍会引发红肿、皮疹、瘙痒、荨麻疹甚至过敏性休克等多种不良反应，临床仍需予以关注。其中，多肽药物致过敏样症状不属于典型的Ⅰ型超敏反应，其严重程度与药物注射剂量密切相关，且可能与肥大细胞直接活化所致药物类过敏反应相关，如艾塞那肽引起的过敏性休克、万古霉素引起的严重“红人综合征”等[4,5,6]。

Mas相关G蛋白偶联受体X2(Mas-related G protein-coupled receptor X2,MRGPRX2）是表达于肥大细胞的一类G蛋白偶联受体[7]。研究显示，激活后的MRGPRX2可促使肥大细胞活化，导致胞内钙离子含量迅速升高，并进一步释放颗粒物质和过敏介质，从而引起类过敏反应[8,9]。有研究证实，P物质（substance P,SP）、促分泌素等内源性多肽和阿片类、四氢异喹啉类、喹诺酮类等小分子药物均可通过直接激活MRGPRX2而引发类过敏反应[10,11]；此外，艾替班特、奥曲肽、西曲瑞克等多肽药物也被证实可通过MRGPRX2激活肥大细胞而引发皮疹、瘙痒甚至过敏性休克等类过敏反应症状，表明MRGPRX2是介导多肽药物致类过敏反应的关键受体[12,13]。

为提高多肽药物的临床安全性、降低多肽药物临床试验的失败率，多项研究针对多肽结构及其激活MRGPRX2的作用进行了评价，发现大多数可激活MRGPRX2的多肽具有相似的序列，包括带正电荷的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）和脂肪族氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）；同时，这类多肽在p H7.0下通常带正电荷，且所含疏水氨基酸比例较高[14,15]。本课题组前期基于SP等肽类物质开展了一系列结构分析及活性评价，构建了一个小分子肽（十一肽以内）化合物库，并从中发现了一种可激活肥大细胞的九肽IVQKIKHCF[由异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、谷氨酰胺（Gln）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、苯丙氨酸（Phe）组成，即H2N-Ile-Val-Gln-Lys-IleLys-His-Cys-Phe-COOH]。在此基础上，本研究拟进一步证实IVQKIKHCF对肥大细胞的激活作用是否与MRGPRX2有关，旨在为多肽药物的设计与开发提供实验基础。

1、材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括MCO-15AC型CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司）、800TS型酶标仪（美国Bio Tek公司）、LCMS-8040型三重四极杆液质联用仪（日本Shi‐madzu公司）、Ti-U型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）等。

1.2 主要药品与试剂

IVQKIKHCF[纯度98%（经高效液相色谱法测定）]由南京肽业生物科技有限公司合成、表征；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM培养基购自美国Corning公司；Stem Pro-34培养基购自美国Invitrogen公司；OptiMEM培养基购自美国Hy Clone公司；100×青-链霉素双抗购自依科赛生物科技（太仓）有限公司；SP购自西安易飞生物科技有限公司；β-氨基己糖、氘代组胺（内标）均购自美国Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Fluo-3 AM/钙离子荧光探针均购自美国Invitrogen公司；Q5®定点突变试剂盒购自美国NEB公司；人肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素8(interleukin-8,IL-8）、巨噬细胞炎症蛋白1β(macro‐phage inflammatory protein-1β,MIP-1β）、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒均购自北京义翘神州生物技术有限公司；Mrgpr X2干扰小RNA(small interfering RNA,si RNA）片段和作为阴性对照的无序si RNA片段均由苏州吉玛基因股份有限公司设计、合成，前者上、下游序列分别为5′-GUACAACAGUGAAUGGAAATT-3′、5′-UUUCCAUUCACUGUUGUACTT-3′，后者上、下游序列分别为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.3 细胞

人肥大细胞系LAD2细胞由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）赠予；人胚胎肾细胞系HEK293细胞和高表达MRGPRX2的人胚胎肾细胞系HEK293细胞（MRGPRX2/HEK293细胞）由赛业（广州）生物科技有限公司提供。

2、方法

2.1 细胞培养

将LAD2细胞接种于含有Gln、100×青-链霉素双抗、人干细胞生长因子和Stem Pro-34营养补液的Stem‐Pro-34培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。将HEK293细胞和MRGPRX2/HEK293细胞分别接种于含有胎牛血清和100×青-链霉素双抗的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。

2.2 β-氨基己糖苷酶释放率的测定

将LAD2细胞按1×105个/孔接种于96孔板（每孔100μL）中，于37℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组和不同浓度IVQKIKHCF组，每组设3个复孔。阳性对照组加入3μmol/L的SP溶液100μL（以p H7.4的台式缓冲液为溶剂，该浓度的SP具有明显的MRGPRX2激活效应[10]，下同）；阴性对照组加入p H7.4的台式缓冲液100μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100μL（以p H7.4的台式缓冲液为溶剂，浓度依据前期预实验结果设置，下同）。于37℃下培养30 min后，以1 500 r/min离心5 min，取各组上清液50μL，加入1 mmol/L的β-氨基己糖溶液[以0.1mol/L柠檬酸溶液-0.1 mol/L柠檬酸钠溶液（26∶24,V/V）为溶剂]50μL，于37℃下孵育90 min后，加入终止液150μL，于室温下振摇混匀2 min，使用酶标仪于405 nm波长下检测各孔的光密度（OD）值。阴性对照组吸弃剩余上清液，细胞加入Trition-X裂解液轻轻吹打后，以2 000 r/min离心5 min，取细胞裂解上清液50μL，同法检测其OD值。按下式计算各组细胞的β-氨基己糖苷酶释放率：β-氨基己糖苷酶释放率=实验组细胞上清液OD值/（阴性对照组上清液OD值+细胞裂解上清液OD值）×100%。

2.3 组胺释放量的测定

将LAD2细胞按1×105个/孔接种于96孔板（每孔100μL）中，于37℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组和不同浓度IVQKIKHCF组，每组设3个复孔。阳性对照组加入3μmol/L的SP溶液100μL；阴性对照组加入台式缓冲液100μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100μL。于37℃下培养30 min后，以1 500 r/min离心5 min，取上清液50μL，加入氘代组胺（内标）溶液100μL，振荡10 s；于4℃下以12 000 r/min离心10 min，吸取上清液50μL，采用液相色谱-串联质谱法定量分析各组细胞的组胺释放量，具体检测条件和计算方法见已发表文献[16]。

2.4 炎症因子释放量的测定

将LAD2细胞按1×105个/孔均匀接种于96孔板（每孔100μL）中，于37℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5min后吸弃上清液，将细胞分为阳性对照组、阴性对照组和不同浓度IVQKIKHCF组，每组设3个复孔。阳性对照组加入3μmol/L的SP溶液100μL；阴性对照组加入台式缓冲液100μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100μL。于37℃下孵育8 h后，以1 500 r/min离心5 min，取上清液，严格按照相应试剂盒说明书操作，采用ELISA法以酶标仪检测各组细胞上清液中炎症因子（TNF-α、IL-8、MIP-1β、MCP-1）的含量。

2.5 敲低Mrgpr X2对细胞β-氨基己糖苷酶释放率的影响

取Mrgpr X2 si RNA片段75 pmol和Lipofectamine2000转染试剂7.5μL，分别稀释于Opti-MEM培养基100μL中，静置2 min后，将上述两者混匀，室温静置15min；将LAD2细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，加入Mrgpr X2 si RNA和Lipofectamine 2000转染试剂的混合液，混匀，得转染Mrgpr X2 si RNA片段的LAD2细胞（KD-LAD2细胞），备用。取无序si RNA片段、Lipo‐fectamine 2000转染试剂和LAD2细胞，同法处理得转染无序si RNA片段的LAD2细胞（NC-LAD2细胞），备用。将上述两种细胞按1×105个/孔接种于96孔板（每孔100μL）中，于37℃下培养过夜；以1 500 r/min离心5 min后吸弃上清液，将两种细胞均分为阳性对照组、阴性对照组和不同浓度IVQKIKHCF组，每组设3个复孔。阳性对照组加入3μmol/L的SP溶液100μL；阴性对照组加入台式缓冲液100μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100μL。于37℃下培养30 min后，按“2.2”项下方法测定并计算各组细胞的β-氨基己糖苷酶释放率。

2.6 细胞内钙离子浓度的检测

将MRGPRX2/HEK293细胞和HEK293细胞按1×104个/孔分别接种于96孔板（每孔100μL）中，于37℃下培养过夜，使其贴壁生长。次日，吸弃培养基，加入p H7.4且含5 ng/m L Fluo-3 AM的钙成像缓冲溶液（cal‐cium imaging buffer,CIB），于37℃下孵育30 min。吸弃上清液，细胞以CIB清洗2次后，将MRGPRX2/HEK293细胞分为阳性对照组、空白对照组、不同浓度IVQKIKHCF组，将HEK293细胞作为阴性对照组，每组设置3个复孔。阳性对照组加入3μmol/L的SP溶液100μL；空白对照组加入CIB 100μL；不同浓度IVQKIKHCF组加入25、50、100μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100μL；阴性对照组加入100μmol/L的IVQKIKHCF溶液100μL。随后，立即使用倒置荧光显微镜观察各组细胞荧光强度的动态变化情况（每秒拍照1张，共拍照120 s），以反映细胞内钙离子浓度的变化情况。

2.7 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。所有数据均采用表示，两组样本的比较采用独立样本t检验；多组样本的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采Dunnett’s（方差不齐）或LSD-t（方差齐）检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 IVQKIKHCF激活LAD2细胞引发脱颗粒反应

SP和25～100μmol/L的IVQKIKHCF均可显著提高LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放量（P<0.05），其中β-氨基己糖苷酶的平均释放率由25μmol/L IVQKIKHCF组的19.92%升高至100μmol/L IVQKIKHCF组的60.69%，组胺的平均释放量由25μmol/L IVQKIKHCF组的71.23 ng/m L升高至100μmol/L IVQKIKHCF组的146.87 ng/m L，均有一定的剂量依赖趋势。结果见图1。

图1 各组LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶、组胺释放情况(n=3)   

3.2 IVQKIKHCF激活LAD2细胞释放炎症因子

与阴性对照组比较，100μmol/L IVQKIKHCF组和阳性对照组细胞上清液中TNF-α、IL-8含量，50、100μmol/L IVQKIKHCF组和阳性对照组细胞上清液中MIP-1β含量，以及各药物组细胞上清液中MCP-1含量均显著升高（P<0.05），其中IL-8、MIP-1β、MCP-1含量的变化有一定的浓度依赖趋势。结果见图2。

图2 各组LAD2细胞的炎症因子释放情况（n=3)  

3.3 IVQKIKHCF对Mrgpr X2敲低LAD2细胞的激活作用减弱

与NC-LAD2细胞比较，IVQKIKHCF对KD-LAD2细胞的激活作用明显减弱，其β-氨基己糖苷酶释放率显著降低（P<0.05），提示IVQKIKHCF可能通过MRGPRX2激活LAD2细胞而引发脱颗粒反应。结果见图3。

图3 各组NC-LAD2细胞和KD-LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放情况（n=3)   

3.4 IVQKIKHCF引起MRGPRX2/HEK293细胞内钙离子浓度升高

与SP类似，在25～100μmol/L的IVQKIKHCF作用下，MRGPRX2/HEK293细胞内钙离子的浓度逐渐升高，且有一定的浓度依赖趋势；但CIB无法升高细胞内的钙离子浓度，同时100μmol/L的IVQKIKHCF亦无法激活HEK293细胞的钙动员，进一步表明IVQKIKHCF可通过激活MRGPRX2而引起细胞内钙离子浓度升高。结果见图4（图中，每条钙成像曲线反映的是单个细胞的钙离子浓度变化情况）。

图4 各组MRGPRX2/HEK293细胞和HEK293细胞的钙成像曲线   

4、讨论

研究指出，MRGPRX2介导的药物过敏反应广泛存在于各类临床药物中，包括抗生素、阿片类镇痛药、肌肉松弛剂等。研究显示，多肽类药物也可激活MRGPRX2，引发类过敏反应，严重者可导致患者休克或死亡[4,5,6]。因此，研究多肽激活MRGPRX2的潜在机制，可有效促进多肽药物的开发，对提高其临床安全性具有重要意义。

β-氨基己糖苷酶是肥大细胞内预合成的代表性颗粒物质[17]，组胺、TNF-α、MIP-1β、MCP-1则是肥大细胞释放的重要过敏介质[8,9]，上述指标在过敏性疾病的发生发展过程中均具有重要作用。研究指出，药物作用于MRGPRX2后可激活肥大细胞，肥大细胞可释放上述颗粒物质和过敏介质，从而诱发类过敏反应，且上述指标的释放量与肥大细胞的激活程度呈正相关，故研究者常通过上述指标的高低来评价药物对肥大细胞及MRGPRX2激活效应的强弱[8,9,17]。本研究结果显示，25～100μmol/L的IVQKIKHCF可显著促进LAD2细胞释放β-氨基己糖苷酶和组胺，且上述作用有一定的浓度依赖趋势；同时，IVQKIKHCF可不同程度地增加LAD2细胞中TNF-α、IL-8、MIP-1β、MCP-1的释放。

与NC-LAD2细胞比较，IVQKIKHCF对KD-LAD2细胞（即敲低Mrgpr X2的LAD2细胞）的激活作用明显减弱，其β-氨基己糖苷酶释放率显著降低，提示IVQKIKHCF可能通过MRGPRX2激活LAD2细胞而引发脱颗粒反应；进一步钙成像实验证实，IVQKIKHCF与MRGPRX2激动剂SP具有相似的效果，可显著升高MRGPRX2/HEK293细胞内的钙离子浓度，且有一定的浓度依赖趋势，但IVQKIKHCF对阴性对照HEK293细胞内的钙离子浓度无明显影响，初步证实IVQKIKHCF是通过MRGPRX2而激活细胞的钙动员。研究指出，钙离子浓度升高可导致LAD2细胞释放颗粒物质、炎症因子及过敏介质，发生类过敏反应，上述过程均直接与MRGPRX2的激活作用相关[10]。

综上所述，九肽IVQKIKHCF可通过MRGPRX2激活肥大细胞LAD2，释放颗粒物质和炎症介质，从而引发类过敏反应。在多肽药物研发时应注意上述结构。

参考文献:

[2]邓丹,明鑫,尹锦,等.基于净效益回归框架的胰岛素类似物与人胰岛素治疗2型糖尿病的成本-效果分析[J].中国药房,2020,31(23):2877-2881.

[6]殷娜,张云芳.我院动物骨多肽类药物致不良反应96例分析[J].中国药房,2017,28(23):3217-3219.

基金资助:陕西省科技计划项目(No.2023-JC-QN-0805);

文章来源:陈晓敏,刘娜,张丽娜等.九肽激活肥大细胞致类过敏反应的作用及其机制[J].中国药房,2023,34(24):2995-2999.