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HPLC测定石榴子中的3种化学成分

2024-02-19 64 上传者：管理员

摘要：目的研究不同干燥温度、干燥时间下石榴子药材中果糖、葡萄糖与5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量的变化规律，为评价石榴子质量提供参考。方法取石榴子药材，置60、80、105℃的烘箱中，分别烘1、4、8、12、18、24、36、48 h后取样；采用Mercury NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),以乙腈-水(70:30)为流动相，流速0.5 mL•min-1,柱温25℃,示差折光检测器测定样品中果糖、葡萄糖的含量；采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),以乙腈-0.1%甲酸溶液(2:98)为流动相，流速1.0 mL•min-1,柱温30℃,检测波长284 nm,测定样品中5-HMF的含量；采用SPSS 26.0软件分析干燥温度、干燥时间与果糖、葡萄糖、5-HMF含量的相关性。结果随干燥温度及干燥时间的增加，石榴子药材中果糖、葡萄糖的含量呈下降趋势，5-HMF的含量呈上升趋势，温度为80、105℃时，变化较为明显；干燥温度、干燥时间与葡萄糖、果糖、5-HMF的含量呈显著相关，其中，葡萄糖、果糖的含量呈负相关，5-HMF的含量呈正相关。结论石榴子药材干燥加工过程中，温度应控制在60℃以内，时间应不超过48 h;所用方法结果准确、重复性好，可为石榴子药材质量标准的制定及质量控制提供参考。

关键词：
5-羟甲基糠醛
干燥时间
干燥温度
石榴子
高效液相色谱法
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石榴子为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥种子[1]。藏药典籍《晶珠本草》中记载：石榴子味酸、甘，功效祛寒气、宣肺、为提升胃火的良药，主治隆病、培根病、胃寒酸胀、冷痛、不消症、食欲不振、呃逆。《四部医典》中将石榴子称作“温药之王”,具有增生胃火、健胃消食、增进食欲之功效，主治培根寒症。石榴子对藏医“三胃火”功能的调节具有重要作用。石榴子现行标准收载于《卫生部药品标准》藏药第一册中，标准规定其炮制方法为“去皮晒干”,现生产企业大规模生产中采用烘干以提高干燥及生产效率。石榴子外种皮中含有较高的果糖、葡萄糖，干燥过程中温度过高，易发生糖苷键的水解和糖的脱水反应，产生5-羟甲基糠醛[2]。5-羟甲基糠醛具有肾毒性、致敏性，对人体横纹肌有损伤，且会对上呼吸道黏膜和眼黏膜产生刺激，通常被定义为限量成分。欧洲食品安全局的安全性评估报告认为：人类对5-羟甲基糠醛的日摄入量按体重应不大于1.5 mg·kg-1[3,4]。故石榴子药材加工过程中的温度控制对临床用药安全尤为重要。现采用HPLC法定量研究石榴子不同干燥条件下果糖、葡萄糖和5-羟甲基糠醛的含量[5,6],考察石榴子干燥过程中3种化学成分含量的变化规律，探讨干燥工艺的质量评定指标，为石榴子的干燥加工与完善其质量标准提供参考。

1、实验部分

1.1仪器与试药

e2695高效液相色谱仪(美国Waters);1260高效液相色谱仪(美国Agilent)。鲜石榴子药材(青海西宁市八一路药材市场，经鉴定为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥种子);5-羟甲基糠醛(5-HMF)、果糖、D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：111626-202013、100231-201606、110833-201707,纯度分别为99.5%、99.7%、99.9%);水为超纯水；乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1药材的处理与溶液的制备

鲜石榴子药材自然晒干，待水分符合标准规定(不得过13.0%)后，测定药材中果糖、葡萄糖、5-HMF的含量；将剩余石榴子药材分成3份，每份60 g,分别置不同温度(60、80、105℃)烘箱中烘干，并于1、4、8、12、18、24、36、48 h后取样，共计25份药材样品。精密称取96.00 mg果糖、93.89 mg D-无水葡萄糖对照品，置25 mL量瓶中，加40%乙腈制成混合对照品贮备液。再精密量取适量对照品贮备液，加40%乙腈制成含1.91 mg·mL-1果糖及1.88 mg·mL-1葡萄糖的混合对照品溶液。取1.0 g石榴子药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 40%乙腈，称定重量，超声处理(200 W、40 kHz)30 min,再称定重量，用40%乙腈补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液Ⅰ。取适量5-HMF对照品，精密称定，加70%甲醇配制成188.25μg·mL-1 5-HMF对照品贮备液；精密量取适量该贮备液，加70%甲醇制成含37.65μg·mL-1 5-HMF对照品溶液。取约0.5 g石榴子药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，超声处理(功率200 W、频率40 kHz)30 min,再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅱ。

1.2.2色谱条件与系统适用性的试验

采用Mercuny NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈-水(70:30),柱温25℃,流速0.5 mL·min-1,漂移管温度105℃,雾化室温度75℃,进样量5μL,理论板数按果糖峰计应≥2×103。采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(2:98),流速1.0 mL·min-1,检测波长284 nm,柱温30℃。理论板数按5-HMF峰计应≥3×103。色谱图见图1。

1.2.3线性关系的考察

精密量取7.78 mg·mL-1果糖、7.69 mg·mL-1 D-无水葡萄糖混合对照品贮备液适量，加40%乙腈稀释成含果糖0.04、0.16、0.78、3.11、5.83、7.78 mg·mL-1,含0.04、0.15、0.77、3.08、5.77、7.69 mg·mL-1葡萄糖的系列线性混合对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定。以峰面积积分值为纵坐标、混合对照品进样量(mg)为横坐标，进行线性回归，得回归方程分别为：Y果糖=3.0506×103X+95.772(r2=0.9988)、Y葡萄糖=2.5549×103X-72.672(r2=0.9992)。0.04～7.78 mg·mL-1果糖、0.04～7.69 mg·mL-1葡萄糖与峰面积呈良好的线性关系。精密量取适量180.69μg·mL-1 5-HMF对照品贮备液，加70%甲醇稀释成浓度为0.54、3.61、18.07、54.21、90.35、180.69μg·mL-1的系列线性对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定。以峰面积积分值为纵坐标、对照品进样量(μg)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=7.6363×104X-7.0271×104(r2=0.9987)。0.54～180.69μg·mL-1 5-HMF与峰面积呈良好的线性关系。

图1果糖与葡萄糖(1)和5-HMF(2)对照品(A)和样品(B)溶液的HPLC色谱图

1.2.4加样回收率的试验

取约0.5 g已知含量的样品(S0号)粉末6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 mL含2.68 mg·mL-1果糖、2.58 mg·mL-1葡萄糖的混合对照品溶液，按“1.2.1”“1.2.2”项方法制备供试品溶液并进样测定，记录峰面积，计算得果糖、葡萄糖的平均回收率分别为98.30%、100.70%,RSD分别为1.04%、1.46%,表明方法较准确；取约0.25 g已知含量的样品粉末(S11号)6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 mL 7.45μg·mL-1 5-HMF对照品贮备液，按“1.2.1”“1.2.2”项方法制备供试品溶液并进样测定，记录峰面积，计算得5-HMF的平均回收率为98.46%,RSD=1.21%,表明方法较准确(表1)。

1.2.5定量限和检测限的考察

将5-HMF对照品溶液逐级稀释，按“1.2.2”项方法进样测定，以信噪比(S/N)10:1和3:1分别计算定量限和检测限，测得仪器的定量限和检测限分别为0.33、0.09μg·mL-1。

表1加样回收率试验的结果(mg, n=6)

1.2.6相关性分析

观察不同干燥温度、干燥时间的石榴子样品性状。60℃下石榴子药材均呈黄红色，性状基本无变化；80℃下石榴子药材的颜色随干燥时间的增加而逐步加深变黑；105℃下干燥4 h后，石榴子药材的颜色急剧加深变为焦黑色。以干燥时间为横坐标、含量为纵坐标分别绘制趋势图，结果石榴子药材随着干燥温度、时间的增加，果糖、葡萄糖的含量呈下降趋势，5-HMF的含量呈增长趋势；温度为60℃时，随干燥时间的增加，果糖、葡萄糖、5-HMF的含量变化趋势不明显(图2A);温度为80℃时，随干燥时间的增加，果糖、葡萄糖的含量降低趋势及5-HMF的含量增长趋势明显(图2B);温度为105℃时，随干燥时间的增加，果糖、葡萄糖的含量大幅下降，5-HMF的含量先急剧增长，加热12 h后呈下降趋势(图2C)。采用SPSS 26.0软件，以干燥温度、干燥时间为自变量(X),以葡萄糖、果糖、5-HMF的含量为因变量(Y),对S0至S24号样品的测定结果进行双变量相关分析，计算干燥温度、干燥时间与葡萄糖、果糖、5-HMF含量的Pearson相关系数。结果石榴子药材中葡萄糖、果糖、5-HMF的含量与干燥温度、干燥时间呈显著相关(P<0.05)或极显著相关(P<0.01),其中，葡萄糖、果糖的含量呈负相关，5-HMF的含量呈正相关(表2)。

图2果糖(A)、葡萄糖(B)、5-HMF(C)含量随干燥时间变化的趋势图

表2干燥温度、干燥时间与葡萄糖、果糖、5-HMF含量的关联度

1.2.7稳定性、重复性与精密度的试验

取同一份(S0号)供试品溶液Ⅰ,分别于0、2、4、8、12、24 h时，进样测定，记录峰面积，计算得果糖、葡萄糖峰面积的RSD分别为0.26%、0.15%(n=6),表明供试品溶液在室温条件下放置24 h基本稳定。精密称取同一样品粉末(S0号)6份，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液Ⅰ,按“1.2.2”项色谱条件测定并记录峰面积，计算得果糖、葡萄糖峰面积的RSD分别为0.48%、0.69%,表明方法的重复性良好。精密吸取含1.91 mg·mL-1果糖、1.88 mg·mL-1葡萄糖的混合对照品溶液，按“1.2.2”项方法测定，连续进样6次，记录峰面积，计算得果糖、葡萄糖峰面积的RSD分别为0.16%、0.07%,表明仪器的精密度良好。取同一份(S11号)供试品溶液Ⅱ,分别于0、2、4、8、12、24 h时进样测定，记录峰面积，计算得5-HMF峰面积的RSD=1.51%(n=6),表明供试品溶液在室温条件下放置24 h基本稳定。精密称取同一样品粉末(S11号)6份，分别按“1.2.1”项方法制备供试品溶液Ⅱ,按“1.2.2”项色谱条件，进样测定并记录峰面积，计算得5-HMF的平均含量为1.50 mg·g-1,RSD=0.60%,表明方法的重复性良好。精密吸取10μL 37.65μg·mL-1 5-HMF对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算得5-HMF峰面积的RSD=0.75%,表明仪器的精密度良好。

1.2.8样品含量的测定

取25份样品，按“1.2.1”“1.2.2”项方法制备供试品溶液并进样测定含量(表3)。

表3石榴子中果糖、葡萄糖、5-HMF含量的测定值(n=2)

2、讨论

5-羟甲基糠醛(5-HMF)是多数中药材炮制过程中的产物，主要源于美拉德反应，即糖类成分在酸性高温环境下与蛋白质或氨基酸发生化学反应，经结构转化产生。石榴子在加热过程中性状发生变化，颜色越来越深，也与美拉德反应相关。为保证石榴子药材干燥后的性状和5-HMF的含量不发生明显变化，应遵循石榴子药材现行标准中的“去皮晒干”方法，若需烘干，干燥温度不宜过高(≤60℃),且干燥时间不宜过长(≤48 h)。为保证石榴子用药安全，建议现行标准中加入果糖、葡萄糖的含量测定项及5-HMF的限量检查项。文中采用HPLC法建立了石榴子药材中果糖、葡萄糖、5-HMF的含量测定方法，该方法操作简单、准确可靠，可作为进一步测定石榴子药材中果糖、葡萄糖、5-HMF含量的方法及限度规定的参考。

参考文献:

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基金资助:藏药经典名方整体质量控制创新基地建设项目(2023ZY004);

文章来源:焦兴苹,范莹莹,武嘉庚等.HPLC测定石榴子中的3种化学成分[J].华西药学杂志,2024,39(01):75-79.