天然产物是发现新型生物活性分子的重要源泉[1]。其中含有5-(3-吲哚基)唑结构的天然产物表现出多种生物活性，如抗病毒[2]、抗菌[3]、抗癌[4]、抗氧化[5]、抑制细胞增殖[6]和杀虫活性[7]。从丁香假单胞杆菌的发酵产物中分离出来的labradorin 1就是一种含有5-(3-吲哚基)唑母核结构的天然产物，其对人肿瘤细胞系MCF-7、KM20L2表现出明显的抗增殖活性，GI50值分别为3.9、3.5µg/m L[8]。1,3,4-二唑是一种含有1个氧原子和2个氮原子的五元芳香杂环化合物，具有广泛的生物活性，包括抗癌[9]、抗微生物[10]、抗真菌[11]、抗炎[12]和抗艾滋病[13]。值得注意的是，由于其独特的结构，常常作为重要的药效团出现在抗肿瘤药物设计中。本研究以labradorin 1为研究对象，采用骨架跃迁策略，将labradorin 1中的唑环替换为1,3,4-二唑环，设计并合成了15个吲哚-1,3,4-二唑类化合物，其结构均经1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS进行确证。通过MTT法测试了目标化合物对He La、SCG-7901和MDA-MB-231 3种肿瘤细胞的体外抗增殖活性，并筛选出活性较好的化合物，进行了作用机制研究。

1、仪器与试剂

Bruker AV III 600核磁共振仪（北京布鲁克科技有限公司）；Waters SYNAPT G2 HDMS高分辨质谱仪（上海沃特世科技有限公司）；Mettler-AB104-S分析天平（梅特勒托利多测量设备有限公司）；IKARCT basic磁力搅拌器（德国艾卡仪器设备有限公司）；EYELA-N1100旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；DLSB-5/20型低温冷却循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；H1型多功能酶标仪（美国Biotek公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；多功能成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；PSC603-07S型荧光显微镜（美国OPLENIC公司）；薄层色谱板GF254（烟台化工厂）；快速柱色谱用硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）。

吲哚-3-甲酰肼（毕得科技有限公司），3,3,3-三氟丙酸乙酯、苯胺、异丙胺、苄胺、对氟苄胺、邻氟苄胺、间氟苄胺、对甲基苯胺、对甲基苄胺、对溴苄胺、对氟苯胺、对氯苯胺、苯乙胺、3-氨甲基吡啶、2-呋喃甲胺、对溴苯胺均购自北京伊诺凯科技有限公司；HATU（韶远科技有限公司），DIEA（安耐吉化学），碳酸钠、氢氧化钠（北京通广精细化工有限公司）；其余试剂均为分析纯，购于天津北联精细化学品开发公司。

人宫颈癌细胞He La、人胃癌细胞SCG-7901、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，二甲亚砜（DMSO，上海阿拉丁试剂有限公司）；噻唑蓝（MTT，碧云天生物技术有限公司）、胎牛血清（货号10099-141）、DMEM高糖培养基（货号8122175）、青霉素-链霉素（货号15140-122）购自Gibco公司；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA,HY-D0940-5 mg,Med Chem Express公司）；含DAPI抗荧光淬灭封片液（P0131-5 m L）购自碧云天生物技术有限公司；Annexin V-APC/PI细胞凋亡试剂盒（AP107-100T）购自联科生物技术有限公司。

2、方法与结果

2.1 化合物的合成

以吲哚-3-甲酰肼为起始原料，通过[4+1]环加成反应、水解反应和缩合反应得到目标化合物，合成路线见图1。

2.1.1 化合物3的合成

将吲哚-3-甲酰肼（100 mg,0.57 mmol）、3,3,3-三氟丙酸乙酯（82.5µL,0.63mmol）、Na2CO3(90.6 mg,0.85 mmol）和无水乙醇（3 m L）依次加入一个干燥的密封管中。将混合物加热至90℃反应7 h,TLC监测反应完全。将反应液冷却至室温，硅藻土滤过，并用醋酸乙酯洗涤，浓缩滤液，残余物经硅胶柱色谱纯化，得到化合物3(160 mg，产率88%）。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.03(s,1H),8.16(d,J=2.9 Hz,1H),8.08(d,J=7.5 Hz,1H,7.53(d,J=7.8 Hz,1H),7.26(ddd,J=7.5、6.7、1.2 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.0、7.0、1.2 Hz,1H),4.25(s,2H),4.17(q,J=7.2 Hz,2H),1.22(t,J=7.1 Hz,3H）。

2.1.2 化合物4的合成

将化合物3(0.59 mmol）溶于四氢呋喃（2 m L）中，加入10%Na OH水溶液1 m L，室温搅拌0.5 h,TLC监测反应完全。反应液浓缩至1 m L，加入稀盐酸调p H值至2左右，析出白色固体，抽滤，收集滤饼，得化合物4(83 mg，产率58%）。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：13.15(s,1H),12.08(s,1H),8.16(d,J=2.9 Hz,1H),8.08(d,J=7.6 Hz,1H),7.53(d,J=7.9Hz,1H),7.28～7.21(m,2H),4.12(s,2H）。

2.1.3 化合物6a～6o的合成

图1化合物6a～6o的合成路线 

将化合物4(0.29mmol）和胺类化合物5(0.37 mmol）溶于DMF(2m L）中，依次加入HATU(0.37 mmol）和DIEA(0.37mmol），室温搅拌2 h,TLC监测反应完全。将反应液倒入水中，用醋酸乙酯（20 m L×3）萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，滤过，减压浓缩至析出大量固体，抽滤，滤饼依次用石油醚、二氯甲烷洗涤，收集滤饼，干燥，得到化合物6a～6o。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苯乙酰胺（6a）：白色固体，收率45.6%。mp 252.0～253.2℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ12.01(s,1H),10.47(s,1H),8.16(d,J=2.7 Hz,1H),8.09(d,J=7.8 Hz,1H),7.60(d,J=7.5 Hz,2H),7.52(d,J=8.0 Hz,1H),7.34(t,J=7.5 Hz,2H),7.26(ddd,J=7.5、6.6、1.3 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.6、7.0、1.3 Hz,1H),7.09(t,J=7.4 Hz,1H),4.18(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ164.5,162.3,159.6,138.7,136.4,128.9(2C),128.1,124.1,123.7,122.9,121.2,120.2,119.2(2C),112.5,99.4,33.6;HR-MS m/z:319.119 5[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(对甲苯基)乙酰胺（6b）：白色固体，收率54.6%。mp249.1～251.6℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(d,J=1.8 Hz,1H),10.37(s,1H),8.15(d,J=2.8 Hz,1H),8.09(d,J=7.5 Hz,1H),7.53(d,J=8.0 Hz,1H),7.49(d,J=8.5 Hz,2H),7.26(ddd,J=7.4、6.5、1.3 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.5、7.4、1.3 Hz,1H),7.14(d,J=8.3 Hz,2H),4.16(s,2H),2.26(s,3H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6）δ164.2,162.3,159.7,136.4,136.2,132.7,129.3(2C),128.1,124.1,122.8,121.2,120.2,119.2(2C),112.4,99.4,33.5,20.5;HR-MS m/z:333.135 2[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苯基)乙酰胺（6c）：白色固体，收率63.5%。mp262.7～264.8℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ12.01(d,J=1.7 Hz,1H),10.53(s,1H),8.16(d,J=2.9 Hz,1H),8.09(d,J=7.8 Hz,1H),7.64～7.61(m,2H),7.53(d,J=8.0 Hz,1H),7.27(ddd,J=7.5、6.6、1.3 Hz,1H),7.22(ddd,J=8.3、7.0、1.2 Hz,1H),7.20～7.16(m,2H),4.17(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：164.4,162.4,159.6,158.2(d,J=240.5 Hz),136.4,135.1(d,J=2.0.Hz),128.1,124.1,122.9,121.2,121.0(d,J=7.8 Hz),120.2,115.5(d,J=21.6 Hz),112.5,99.4,33.5;HR-MS m/z:337.110 1[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氯苯基)乙酰胺（6d）：白色固体，收率49.0%。mp254.5～256.0℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.02(d,J=2.1 Hz,1H),10.61(s,1H),8.16(d,J=2.9 Hz,1H),8.10(d,J=7.5 Hz,1H),7.65～7.63(m,2H),7.53(d,J=7.9 Hz,1H),7.40～7.38(m,2H),7.27(ddd,J=7.7、6.6、1.2Hz,1H),7.23(ddd,J=8.2、7.8、1.2 Hz,1H),4.20(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ164.8,162.5,159.6,137.8,136.6,128.9(2C),128.2,127.4,124.2,123.0,121.3,120.9(2C),120.3,112.6,99.5,33.8;HR-MS m/z:353.080 5[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苯基)乙酰胺（6e）：白色固体，收率34.8%。mp256.3～258.0℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.02(d,J=1.8 Hz,1H),10.61(s,1H),8.12(d,J=2.3 Hz,1H),8.08(d,J=7.5 Hz,1H),7.59(d,J=7.5 Hz,2H),7.54～7.52(m,3H),7.27(ddd,J=7.6、6.5、1.2 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.2、7.0、1.2 Hz,1H),4.20(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ164.9,162.4,159.5,138.1,136.4,131.7(2C),128.1,124.1,122.9,121.2(2C),121.1,120.2,115.3,112.5,99.4,33.7;HR-MS m/z:397.030 0[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-苄基乙酰胺（6f）：白色固体，收率64.5%。mp 237.2～239.2℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(s,1H),8.87(t,J=5.9 Hz,1H),8.12(d,J=2.9 Hz,1H),8.08(d,J=7.9 Hz,1H),7.53(d,J=7.7 Hz,1H),7.35～7.30(m,4H),7.28～7.23(m,3H),4.34(d,J=5.9 Hz,2H),4.00(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ165.6,162.2,159.9,139.0,136.4,128.4(2C),128.0,127.3(2C),127.0,124.1,122.9,121.2,120.2,112.5,99.5,42.5,32.6;HR-MS m/z:333.135 2[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-甲基苄基)乙酰胺（6g）：白色固体，收率55.2%。mp243.0～245.6℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(d,J=1.5 Hz,1H),8.81(t,J=5.9 Hz,1H),8.12(d,J=2.9 Hz,1H),8.07(d,J=7.8Hz,1H),7.53(d,J=8.3 Hz,1H),7.27(ddd,J=7.6、6.6、1.3 Hz,1H),7.22(ddd,J=8.2、7.0、1.1 Hz,1H),7.19(d,J=7.9 Hz,2H),7.14(d,J=7.9 Hz,2H),4.29(d,J=5.9 Hz,2H),3.97(s,2H),2.28(s,3H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ165.5,162.2,159.9,136.4,136.0,135.9,128.9(2C),128.0,127.4(2C),124.1,122.9,121.2,120.2,112.5,99.5,42.2,32.6,20.7;HR-MS m/z:347.150 8[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6h）：白色固体，收率40.4%。mp 195.2～197.9℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(d,J=1.5 Hz,1H),9.03(t,J=6.3Hz,1H),8.21(d,J=8.8 Hz,2H),8.14(d,J=2.7 Hz,1H),8.07(d,J=7.9 Hz,1H),7.58(d,J=9.0 Hz,2H),7.53(d,J=7.9 Hz,1H),7.27(ddd,J=8.3、7.5、1.1 Hz,1H),7.22(ddd,J=8.0、6.9、1.0 Hz,1H),4.48(d,J=6.1 Hz,2H),4.04(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ166.0,162.3,159.8,147.2,146.5,136.4,128.3(2C),128.0,124.1,123.6(2C),122.9,121.2,120.2,112.5,99.6,42.0,32.5;HR-MS m/z:378.120 2[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(2-氟苄基)乙酰胺（6i）：白色固体，收率48.2%。mp237.2～239.5℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(d,J=1.3 Hz,1H),8.88(t,J=5.9 Hz,1H),8.12(d,J=2.9 Hz,1H),8.07(d,J=7.7Hz,1H),7.53(d,J=8.0 Hz,1H),7.42～7.39(m,1H),7.35～7.32(m,1H),7.26(ddd,J=7.5、6.7、1.3 Hz,1H),7.24～7.17(m,3H),4.37(d,J=5.8 Hz,2H),4.00(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ165.7,162.2,160.13(d,J=244.4 Hz),159.8,136.4,129.7(d,J=4.4 Hz),129.1(d,J=8.4 Hz),128.0,125.5(d,J=15.0 Hz),124.4(d,J=3.5 Hz),124.1,122.9,121.2,120.2,115.2(d,J=21.1 Hz),112.5,99.5,36.4(d,J=4.4 Hz),32.5;HR-MS m/z:351.125 7[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(3-氟苄基)乙酰胺（6j）：白色固体，收率48.3%。mp239.2～241.5℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(s,1H),8.91(t,J=6.0 Hz,1H),8.12(d,J=2.8 Hz,1H),8.07(d,J=7.7 Hz,1H),7.53(d,J=7.9 Hz,1H),7.40～7.36(m,1H),7.26(ddd,J=7.5、6.6、1.2 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.4、7.1、1.1 Hz,1H),7.17～7.13(m,2H),7.11～7.07(m,1H),4.36(d,J=6.0 Hz,2H),4.02(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：165.7,162.2,160.1(d,J=244.4 Hz),159.8,136.4,129.7(d,J=4.4 Hz),129.1(d,J=8.4 Hz),128.0,125.5(d,J=15.0 Hz),124.4(d,J=3.5 Hz),124.1,122.9,121.2,120.2,115.2(d,J=21.1 Hz),112.5,99.5,36.4(d,J=4.4 Hz),32.5;HR-MS m/z:351.125 7[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-氟苄基)乙酰胺（6k）：白色固体，收率51.5%。mp229.6～231.0℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(d,J=1.8 Hz,1H),8.88(t,J=5.9 Hz,1H),8.12(d,J=2.7 Hz,1H),8.07(d,J=7.7Hz,1H),7.53(d,J=8.2 Hz,1H),7.37～7.33(m,2H),7.27(ddd,J=7.4、6.8、1.3 Hz,1H),7.22(ddd,J=8.4、7.3、1.2 Hz,1H),7.19～7.15(m,2H),4.32(d,J=5.8 Hz,2H),3.32(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：165.6,162.2,161.3(d,J=242.0 Hz),159.9,136.4,135.2(d,J=3.2Hz),129.3(d,J=8.0 Hz),128.0,124.1,122.9,121.2,120.2,115.1(d,J=21.0 Hz),112.5,99.5,41.8,32.5;HR-MS m/z:351.125 7[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-溴苄基)乙酰胺（6l）：白色固体，收率33.6%。mp210.2～212.2℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(s,1H),8.90(t,J=6.2 Hz,1H),8.13(s,1H),8.07(d,J=7.3 Hz,1H),7.52～7.54(m,3H),7.28～7.21(m,4H),4.31(d,J=6.2 Hz,2H),4.00(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：165.7,162.3,159.8,138.5,136.4,131.2(2C),129.6(2C),128.0,124.1,122.9,121.2,120.2,120.0,112.5,99.4,41.8,32.5;HR-MS m/z:411.045 7[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(4-硝基苄基)乙酰胺（6m）：白色固体，收率72.9%。mp193.4～194.8℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.01(d,J=1.9 Hz,1H),8.93(t,J=5.8 Hz,1H),8.54(d,J=1.5 Hz,1H),8.48(d,J=8.5 Hz,1H),8.12(d,J=9.0 Hz,1H),8.07(d,J=7.8 Hz,1H),7.72(d,J=7.8 Hz,1H),7.53(d,J=7.8 Hz,1H),7.37(dd,J=4.7、3.0 Hz,1H),7.27(ddd,J=7.5、6.8、1.3 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.3、7.5、1.2 Hz,1H),4.37(d,J=5.8 Hz,2H),4.00(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：165.8,162.3,159.8,148.8,148.3,136.4,135.2,134.5,128.0,124.1,123.5,122.9,121.2,120.2,112.5,99.4,40.2,32.5;HR-MS m/z:334.130 4[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-(呋喃-2-基甲基)乙酰胺（6n）：白色固体，收率39.6%。mp 208.5～210.5℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.02(d,J=1.9 Hz,1H),8.84(t,J=5.5Hz,1H),8.13(d,J=2.8 Hz,1H),8.08(d,J=7.7 Hz,1H),7.61(dd,J=1.9 Hz,J=0.8 Hz,1H),7.53(d,J=8.0,1H),7.27(ddd,J=7.7、6.7、1.3 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.5、7.3、1.2 Hz,1H),6.42(dd,J=3.8、1.8 Hz,1H),6.31(dd,J=3.2、0.6 Hz,1H),4.33(d,J=5.6 Hz,2H),3.96(s,2H);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6）δ：165.6,162.4,159.5,151.8,142.5,136.5,128.1,124.2,123.0,121.3,120.3,112.6,110.6,107.3,99.6,35.9,32.5;HR-MS m/z:323.114 4[M+H]+。

2-[5-(1H-吲哚-3-基)-1,3,4-二唑-2-基]-N-异丙基乙酰胺（6o）：白色固体，收率67%。mp 242.0～243.6℃；1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6）δ：12.00(s,1H),8.26(d,J=7.7 Hz,1H),8.12(d,J=2.3Hz,1H),8.08(d,J=7.5 Hz,1H),7.53(d,J=7.5 Hz,1H),7.26(ddd,J=7.5、6.6、1.3 Hz,1H),7.23(ddd,J=8.4、7.3、1.2 Hz,1H),3.88～3.83(m,3H),1.10(d,J=6.6 Hz,6H);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6）δ：164.4,163.2,160.0,136.4,127.9,124.1,122.8,121.1,120.2,112.5,99.5,55.0,40.9,32.6,22.3(2C);HR-MS m/z:285.135 2[M+H]+。

2.2 化合物的抗肿瘤活性研究

2.2.1 目标化合物对肿瘤细胞增殖的影响

采用MTT法测试目标化合物6a～6o对He La、SCG-7901和MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤活性。将He La、SCG-7901、MDA-MB-231细胞以5×104个/m L密度接种到96孔板中，每孔100μL。在CO2培养箱中培养24 h。设置对照组和给药组，给药组每孔加入梯度稀释的化合物6a～6o药液（终浓度分别为2.5、5、10、20、40μmol/L)200μL，对照组加入含有等体积DMSO的培养基。培养48 h后，加入5 mg/m L MTT溶液5μL，再继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100μL，震荡10 min，酶标仪测定490 nm波长处的吸光度（A）值。实验设置3个平行孔，重复2次，取平均值。采用Graph Pad Prism 9计算目标化合物6a～6o对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50），结果见表1。

化合物6f、6g、6k、6l表现出抗肿瘤活性，其中化合物6f、6g对3种肿瘤细胞均表现出良好的抗增殖作用。活性最好的化合物6f对He La、SCG-7901和MDA-MB-231细胞的IC50分别为（4.35±0.32）、（3.94±0.03）、（4.04±1.06）μmol/L。初步的构效关系研究表明，苄胺衍生物具有良好的抗肿瘤活性。其中苄胺的苯环上无取代基或为甲基取代基时，衍生物表现出明显的抗肿瘤活性。当苯环上的取代基替换为卤素或硝基取代时则活性下降，甚至消失，说明苄胺的苯环上连有供电子基团有助于抗肿瘤活性。当酰胺的氨基部分由苄胺替换为苯胺、烷基胺时，衍生物的抗肿瘤活性丧失。此外，将苄胺的苯基替换为吡啶或呋喃基团时，衍生物同样无明显抗肿瘤作用。说明苄胺基团对衍生物发挥抗肿瘤活性至关重要。  

表1化合物6a～6o的体外抗肿瘤活性  

为了进一步考察目标化合物抗肿瘤作用是否具有选择性，实验测试了化合物6f、6g对人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1存活率的影响，结果见表1。结果显示，化合物6f、6g的选择性指标[SI,SI=IC50(CCC-HPF-1)/IC50(SGC-7901)]分别为3.54、11.09，具有良好的细胞选择性。考虑到化合物6f的活性更优，故选择化合物6f进行后续实验。

2.2.2 化合物6f抑制SCG-7901细胞增殖

采用克隆形成实验考察化合物6f对SCG-7901细胞增殖的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901细胞，调整细胞密度至800个/m L，接种于6孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40μmol/L，空白组加入含等体积DMSO的培养基。培养14 d后，弃去上清液，加入4%多聚甲醛固定细胞10 min，除去4%多聚甲醛。使用结晶紫染色液染色10 min，水洗除去多余的结晶紫染色液，晾干后进行拍照记录。用Image J软件分析细胞集落数量（大于50个细胞的细胞群为1个集落），结果见图3。在40μmol/L的浓度下，化合物6f可显著抑制细胞集落的形成，SCG-7901细胞的平均集落数量由711个（空白组）减少至2个。

2.2.3 化合物6f诱导SCG-7901细胞凋亡和坏死

采用Annexin V-APC/PI双染法检测化合物6f对SCG-7901细胞凋亡和坏死的影响[14]。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901细胞，调整细胞密度至3×105个/m L，接种于6孔板中，每孔1m L。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为10、20、40μmol/L，空白组加入含等体积DMSO的培养基。培养24 h后，收集细胞，PBS洗涤细胞，将细胞转移至流式管中，向流式管内分别加入Annexin V-APC(10μL）和PI(5μL）染液，室温孵育10 min，使用流式细胞仪检测凋亡和坏死细胞的比例。并使用Flow Jo软件进行数据分析，数据显示为伪彩图，结果见图4。40μmol/L化合物6f处理24 h后，SCG-7901细胞的早期凋亡细胞占比由4.76%升高到17.6%，晚期凋亡细胞占比由1.92%上升到13.2%。细胞凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡）随浓度的升高而升高，呈一定的浓度相关性。提示化合物6f通过促进肿瘤细胞的凋亡从而发挥抗肿瘤作用。

图3化合物6f对SCG-7901细胞增殖的影响  

图4化合物6f对SCG-7901细胞凋亡的影响（x±s,n=3)  

2.2.4 化合物6f对SCG-7901细胞形态学的影响

采用DAPI染色法检测化合物6f对SCG-7901细胞凋亡核染色质形态学的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期SCG-7901细胞，以4×104个/m L的细胞密度接种于置有直径为8 mm爬片的48孔板内，待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20μmol/L，空白组加入含等体积DMSO的培养基。培养24 h，弃去上清，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞10 min,PBS洗涤细胞3次，取出爬片，置于含有DAPI抗荧光淬灭封片液的载玻片上，4℃孵育15 min，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图5。空白组的细胞核形态规则，且呈弥散均匀的淡蓝色荧光。给予不同浓度的化合物6f后，SCG-7901细胞的细胞核固缩，染色质高度凝聚，说明化合物6f能够诱导SCG-7901细胞的凋亡。

图5化合物6f对SCG-7901细胞核形态变化的影响

2.2.5 化合物6f诱导SCG-7901细胞活性氧（ROS）水平升高

采用DCFH-DA染色法检测化合物6f对SCG-7901细胞中ROS含量的影响。实验设置空白组和给药组。取对数生长期的SCG-7901细胞，以3×105个/m L的细胞密度接种于24孔板内。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的化合物6f，终浓度分别为5、10、20μmol/L，空白组加入含等体积DMSO的培养基。培养24 h，弃去上清液，加入DCFH-DA荧光探针（10μmol/L），室温避光孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3次，使用荧光显微镜观察染色情况并拍照记录，结果见图6。与空白组相比，化合物6f处理后的细胞内DCFH-DA的平均荧光强度明显增强，说明细胞内的ROS水平显著升高，且具有剂量相关性。结果表明，化合物6f可有效促进SCG-7901细胞活性氧的生成。

3、讨论

labradorin 1是一种具有抗肿瘤活性的天然产物，实验在labradorin 1的结构基础上采用

骨架跃迁策略合成了一系列吲哚-1,3,4-二唑类衍生物，部分化合物表现出良好的抗肿瘤作用，其中化合物6f表现出最好的抗肿瘤活性，并具有一定的细胞选择性，说明酰胺的氨基部分为苄胺基团取代时活性最优。此外化合物6f对所测试的3种肿瘤细胞株均表现出抗增殖作用，说明化合物6f还具有抗肿瘤谱广的特点。作用机制研究发现，该类衍生物可以诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。其中衍生物诱导肿瘤细胞凋亡作用可能与促进肿瘤细胞内ROS的产生，进而造成线粒体损伤有关[15,16]。

图6化合物6f对SCG-7901细胞内ROS水平的影响 

基金资助:国家重大新药创制科技重大专项(2019ZX09735002);中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2022-I2M-1-017);

文章来源:郑煦阳,李凌宇,胡玥,等.吲哚-1,3,4-二唑类衍生物的合成及其体外抗肿瘤活性研究[J].现代药物与临床,2024,39(04):886-893.