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基于RIP1/RIP3探究西地那非对勃起功能障碍大鼠睾丸的影响

2024-07-09 50 上传者：管理员

摘要：目的探究程序性坏死通路在勃起功能障碍(ED)大鼠睾丸组织损伤中的作用及西地那非干预的机制。方法用高脂饲料喂养的方法建立ED大鼠模型，将其随机分为模型组、实验组、白细胞介素18组和实验+白细胞介素18组；另随机取10只大鼠为正常对照组。实验组灌胃20 mg·kg-1西地那非；白细胞介素18组腹腔注射0.2μg·kg-1白细胞介素18重组蛋白；实验组+白细胞介素18组灌胃20 mg·kg-1西地那非、腹腔注射0.2μg·kg-1白细胞介素18重组蛋白；正常对照组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl和腹腔注射等量0.9%NaCl;实验组腹腔注射等量0.9%NaCl,白细胞介素18组灌胃等量0.9%NaCl, 5组大鼠每天定时给药1次，连续给药14 d。用逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测大鼠睾丸组织中程序性坏死关键因子受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)和钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达。结果正常对照组、模型组、实验组、白细胞介素18组和实验+白细胞介素18组RIP1蛋白相对表达水平分别为0.58±0.05、0.99±0.09、0.71±0.05、1.23±0.07和0.81±0.07,RIP3蛋白相对表达水平分别为0.61±0.05、1.05±0.10、0.77±0.04、1.19±0.07和0.84±0.08,MLKL蛋白相对表达水平分别为0.63±0.05、1.13±0.08、0.79±0.05、1.30±0.02和1.00±0.04,CaMKⅡ蛋白相对表达水平分别为0.54±0.04、1.12±0.07、0.77±0.05、1.36±0.04和1.00±0.07;上述指标，模型组与正常对照组比较，实验组与模型组比较，白细胞介素18组与模型组比较，实验+白细胞介素18组与白细胞介素18组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 RIP1/RIP3介导的程序性坏死通路在ED大鼠睾丸损伤中发挥多重调控作用，西地那非可能通过抑制上述程序性坏死信号通路，改善大鼠睾丸功能。

关键词：
勃起功能障碍
受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3
睾丸
程序性坏死
西地那非
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勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)指在性刺激下阴茎不能正常勃起或不能长时间维持勃起的一种男性性功能障碍疾病[1]。研究表明，睾丸损伤与ED发生发展密切相关[2]。西地那非作为ED的一线治疗药物已得到广泛应用[3],但其对睾丸损伤是否有影响尚不明确。程序性坏死是近年新发现的一种死亡形式，受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein 1,RIP1)/受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein 3,RIP3)是其关键信号通路，可诱发高水平炎症反应，造成细胞死亡[4]。本研究旨在探究程序性坏死在ED大鼠睾丸组织损伤中的作用及西地那非新的药理作用。

一、材料和方法

1 材料

动物SPF级健康雄性 Sprag-Dawley大鼠，鼠龄6周，体质量240～260 g, 新疆医科大学动物实验中心提供。动物许可证号：SCXK(新)2018-0003。本实验经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准(伦理批号：IACUC-20180222-60)。

药品与试剂西地那非，规格：每瓶1 g, 纯度：98%,批号：S6070,北京索莱宝公司生产。45%高脂饲料，北京华阜康公司生产；白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)重组蛋白，美国R&D system公司生产；兔抗大鼠RIP1、RIP3抗体，均由武汉Protechintech公司生产；兔抗大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α,TNF-α)、混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase structural domain like protein, MLKL)和钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium-calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ),均为江苏Affnity公司生产；BCA蛋白浓度测定试剂盒、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂盒，均为北京天根公司生产。

仪器CX43普通光学显微镜，日本OLYMPUS公司产品；PowerPac Western Blot 电泳套装，美国Bio-RAD公司产品；QuantStudioTM 1 Plus System PCR仪，杭州博日科技股份有限公司产品。

2 实验方法

2.1 模型建立

将SD大鼠随机分为正常对照组(10只),ED组(45只)。根据文献[5]的方法，ED组用高脂饲料喂养12 周，通过交配实验和阿朴吗啡勃起实验筛选高脂饮食ED大鼠模型，共筛选出32 只[6]。正常对照组给予等量普通饲料喂养12周。

2.2 分组与药物干预[6]6]

将32 只高脂饮食ED大鼠模型随机分为模型组、实验组、白细胞介素18组和实验+白细胞介素18组，每组8 只。实验组西地那非灌胃(20 mg·kg-1西地那非，qd,连续14 d),白细胞介素18组腹腔注射IL-18重组蛋白(0.2 μg·kg-1 IL-18,qd,连续14 d)。实验+白细胞介素18组给予等量西地那非灌胃和IL-18重组蛋白注射。正常对照组和模型组给予等量0.9%NaCl灌胃和腹腔注射，实验组给予等量0.9%NaCl腹腔注射，白细胞介素18组给予等量0.9%NaCl灌胃。

2.3 苏木精-伊红染色观察睾丸组织的病理学变化[6]6]

取大鼠睾丸组织5 μm石蜡切片、脱蜡、水化，苏木精浸染4 min, 自来水冲洗，伊红浸染20 s, 脱水、透明、封片，光镜下观察并采集图像。

2.4 免疫组化染色检测睾丸组织中IL-1β和TNF-α的表达[6]6]

取大鼠睾丸组织5 μm石蜡切片，脱蜡，水化，抗原修复，兔抗IL-1β(1∶100)、TNF-α(1∶100)一抗4 ℃孵育过夜，复温，抗兔二抗37 ℃孵育20 min, DAB显色液显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，光镜下观察，采集图像，用Image J软件进行分析。

2.5 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测睾丸组织中RIP1、RIP3、MLKL和CaMK Ⅱ mRNA水平[6]6]

用RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂提取大鼠睾丸组织总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,用SuperReal荧光定量预混试剂进行扩增反应。根据所得CT值计算2-△△Ct。

2.6 蛋白质印迹法检测睾丸组织中RIP1、RIP3、MLKL和CaMKⅡ蛋白相对表达水平[6]6]

取大鼠睾丸组织放入EP管中，加入PMSF的RIPA裂解液，4 ℃、1.20×104 r·min-1离心15 min, 取上清液。对提取的蛋白进行浓度测定。取蛋白20 μg上样，进行SDS-PAGE电泳分离90 min、转膜120 min、脱脂牛奶封闭120 min, 加入一抗4 ℃摇床孵育过夜，抗兔二抗(1∶1.0×104)摇床孵育120 min, 显色，采集图像，用Image J软件分析。

3 统计学方法

用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素ANOVA分析。

二、结果

1 各组大鼠睾丸组织病理学变化的比较

实验组灌胃20 mg·kg-1西地那非；白细胞介素18组腹腔注射0.2 μg·kg-1白细胞介素18重组蛋白；实验组+白细胞介素18组灌胃等量西地那非、腹腔注射等量白细胞介素18重组蛋白；正常对照组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl和腹腔注射等量0.9%NaCl; 实验组腹腔注射等量0.9%NaCl, 白细胞介素18组灌胃等量0.9%NaCl。

苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组大鼠睾丸组织内间质细胞清晰可见，生精小管完整且排列紧密，各级生精细胞排列齐整、层次分明，无明显脱落。模型组和白细胞介素18组大鼠睾丸组织内间质细胞减少，生精小管排列疏松，各级生精细胞排列紊乱、层次不清，有明显脱落。实验组和实验+白细胞介素18组较模型组和白细胞介素18组，大鼠睾丸组织内间质细胞增多，生精小管排列更完整，各级生精细胞排列紧密、层次清晰，脱落细胞减少，见图1。

图1 苏木精-伊红染色观察大鼠睾丸组织病理变化(×200)

2 各组大鼠睾丸组织中炎症因子IL-1β和TNF-α含量的比较

免疫组织化学结果显示，正常对照组、模型组、实验组、白细胞介素18组和实验+白细胞介素18组大鼠睾丸组织IL-1β含量分别为130.29±7.38、209.68±3.95、164.53±5.34、238.44±4.55和171.45±5.80,TNF-α含量分别为123.75±7.47、216.18±6.40、165.85±6.23、264.37±5.74和190.52±5.09。大鼠睾丸组织内IL-1β、TNF-α的表达，模型组与正常对照组比较，实验组与模型组比较，白细胞介素18组与模型组比较，实验+白细胞介素18组与白细胞介素18组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 各组大鼠睾丸组织中RIP1、RIP3、MLKL和CaMKⅡ mRNA水平的比较

RT-qPCR结果显示，大鼠睾丸组织内RIP1、RIP3、MLKL和CaMKⅡ mRNA表达水平，模型组与正常对照组比较，实验组与模型组比较，白细胞介素18组与模型组比较，实验+白细胞介素18组与白细胞介素18组比较，在统计学上差异均具有统计学意义(均P<0.05),见表1。

4 各组大鼠睾丸组织中RIP1、RIP3、MLKL、CaMKⅡ蛋白含量的比较

蛋白质印迹法结果显示，正常对照组、模型组、实验组、白细胞介素18组和实验+白细胞介素18组大鼠睾丸组织RIP1蛋白相对表达水平分别为0.58±0.05、0.99±0.09、0.71±0.05、1.23±0.07、0.81±0.07,RIP3蛋白相对表达水平分别为0.61±0.05、1.05±0.10、0.77±0.04、1.19±0.07、0.84±0.08,MLKL蛋白相对表达水平分别为0.63±0.05、1.13±0.08、0.79±0.05、1.30±0.02、1.00±0.04,CaMKⅡ蛋白相对表达水平分别为0.54±0.04、1.12±0.07、0.77±0.05、1.36±0.04、1.00±0.07。模型组上述指标与正常对照组比较，实验组与模型组比较，白细胞介素18组上述指标与模型组比较，实验+白细胞介素18组上述指标与白细胞介素18组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表1 逆转录聚合酶链反应检测大鼠睾丸组织中受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)、钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ) mRNA水平

三、讨论

ED是一种常见男性疾病，病因十分复杂。睾丸作为重要生殖器官之一，其功能变化与阴茎勃起间存在密切联系[7]。LIU等[8]研究发现，高脂饮食可使睾丸功能减退，降低体内雄激素的分泌，而ZHAO等[9]发现低雄激素会抑制阴茎勃起功能。本研究通过持续性高脂饲料喂养构建ED大鼠模型，发现高脂饲料喂养的ED大鼠也可造成睾丸发生器质性损伤。

研究表明ED的发生与高脂饮食诱导的炎症反应有密切关系[10]。本研究中ED大鼠睾丸组织内炎症因子IL-1β和TNF-α呈高水平表达，与上述研究结果一致。本实验进一步对大鼠进行腹腔注射IL-18重组蛋白，结果发现大鼠睾丸内炎症水平相较于ED大鼠显著升高且组织损伤加剧。证实炎症反应是高脂饮食诱导的ED大鼠睾丸损伤的因素之一。

程序性坏死是近年来新发现的一种促炎性程序性死亡方式，其中RIP1/RIP3被证明是该死亡形式的关键上游信号通路[11]。该通路被激活后，可招募并磷酸化下游的细胞坏死执行蛋白MLKL,促使其转移至细胞膜上，诱导胞膜破裂，最终导致细胞崩解死亡[12]。另有研究证明，CaMKⅡ是RIP3的另一作用底物，其被活化后可使得大量钙离子在胞浆或线粒体基质中累积，促进线粒体膜通透性转换孔打开，诱导线粒体肿胀破裂，腺苷三磷酸生成受阻，能量耗竭引发细胞损伤甚至死亡[13]。本研究发现，高脂饮食诱导的ED组大鼠睾丸组织中，不仅炎症水平显著增加，还伴有程序性坏死关键因子RIP1、RIP3、MLKL以及CaMKⅡ高表达现象。此外，在IL-18干预大鼠睾丸组织中上述关键程序性坏死通路蛋白水平相较于ED大鼠均显著增加，进一步证实睾丸组织高水平的炎症反应可能通过上调程序性坏死，进而影响大鼠睾丸功能。这与炎症和程序性坏死间的因果关系一致[14]。本研究结果证实，在高脂饮食诱导的ED大鼠睾丸组织损伤中，细胞程序性坏死程度与炎症水平有关。

西地那非是ED一线治疗药物之一。本研究通过西地那非干预后，发现ED大鼠和IL-18重组蛋白注射大鼠睾丸内间质细胞增多，IL-1β、TNF-α等炎症因子浓度显著降低。这与西地那非可通过抑制炎症因子的生成而改善患者的勃起功能的研究结果一致[15]。提示西地那非在发挥ED治疗过程中，还可通过其抗炎功能减轻ED大鼠睾丸组织结构损伤。此外，西地那非干预还可有效下调大鼠睾丸组织内RIP1、RIP3、MLKL和CaMKⅡ等关键程序性坏死因子的含量，表明西地那非还可通过抑制RIP1/RIP3信号通路介导的程序性坏死，改善了睾丸组织损伤情况。

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81860781); 新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2021D01C280);

文章来源:刘玉莲,牛立盼,杨培,等.基于RIP1/RIP3探究西地那非对勃起功能障碍大鼠睾丸的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1938-1942.