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UPLC-MS/MS法同时检测血液中15种常见安眠镇静药物

2024-08-29 75 上传者：管理员

摘要：建立一种超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-MS/MS)同时检验血液中15种常见安眠镇静药物的方法。采用快速便捷的乙腈沉淀蛋白法提取血液中安眠镇静药物，通过Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱分离，电喷雾离子源正离子模式(ESI+)下，多反应监控(MRM)模式检测。结果表明，血液中15种常见安眠镇静药物检出限在0.08 ng/mL～0.29 ng/mL之间，定量限在0.25 ng/m～0.96 ng/mL之间；在1 ng/m～50 ng/mL范围内线性关系良好，R2均大于0.9979；在低、中、高(2 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)三种添加浓度中基质效应在81.06%～100.72%之间，提取回收率在76.86%～102.0%之间，日内、日间精密度RSD均不大于7.68%。本方法专属性好、灵敏度高、准确性好，可用于快速检验血液中15种常见安眠镇静药物。

关键词：
催眠
公共安全
安眠镇静药物
血液
超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱
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安眠镇静类药物作为一种促使人体镇静、催眠、抗惊厥和肌肉松弛等作用的药物被广泛用于睡眠障碍、抗焦虑和癫痫等疾病的临床治疗[1-3]。目前，因常见安眠镇静药物在日常生活中便宜易得且在人体中见效快，常被犯罪分子应用于药物辅助犯罪案件中，如使用安眠镇静药物进行麻醉强奸和麻醉抢劫等，给社会带来严重的公共安全事件[4-6]。除此之外，安眠镇静药物在误服和自杀事件中也常有发生[7-8]。因此，建立血液中常见安眠镇静药物检验方法为案件侦破和医院毒物排查提供参考具有重要意义。

目前，针对血液中安眠镇静药物的检验方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[9-11]，气相色谱法(GC)[12-13]，气相色谱-质谱法(GC-MS)[14-15]、液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[16-18]。与高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱-质谱法相比，液相色谱-串联质谱法不仅具有高敏度而且测定准确，抗干扰能力强等优点被常用于检验血液中的中毒药物。因安眠镇静药物在体内代谢快，在血液中含量大多为痕量且受到血液中内源性干扰较强，所以选择液相色谱-串联质谱法进行分析[1,17-18]。另外，在保证对血液中安眠镇静药物检出灵敏度的前提下，本文选择与固相萃取后浓缩[1,16]、液液萃取后浓缩[12,13]相比更为便捷高效的乙腈沉淀蛋白法进行前处理，从而保障司法鉴定的时效性。本文以在司法检验鉴定实践中血液检材检出频率较高的15种常见安眠镇静药物为检测对象，采用便捷高效的沉淀蛋白前处理方法和具有高灵敏度、快速且准确的UPLC-MS/MS的检验方法对血液中15种常见安眠镇静药物的定性定量方法进行了研究，为司法鉴定机构和医院临床中毒药物排查提供了相应的借鉴和参考。

1、实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱：EXPEC 5210(杭州谱育科技公司)；Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱(美国沃特世公司)；甲醇、乙腈和异丙醇、甲酸(色谱级，美国默克公司)；15种常见安眠镇静药物单标准溶液：佐匹克隆、褪黑素、咪达唑仑、扎莱普隆、卡马西平、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、硝甲西泮、艾司唑仑、三唑仑、阿普唑仑、劳拉西泮、奥沙西泮、地西泮(浓度均为0.1 mg/mL，纯度≥98%；天津阿尔塔公司)；娃哈哈纯净水；实验用血均来自中心血站。

1.2 标准溶液配制

将浓度为0.1 mg/mL的15种常见安眠镇静药物单标准溶液作为储备液置于冰箱内冷冻保存，保存时间12个月。取适量上述储备液并依次配制浓度为1μg/mL的15种常见安眠镇静药物单标准溶液作为工作液置于冰箱中冷藏保存，保存时间1个月。

1.3 样品前处理

取血液检材1 mL置于10 mL离心管中，再加入乙腈3 mL，充分振荡后离心5 min(10000 r/min)，精确吸取1 m L上清液过0.22μm有机微孔滤膜，取5μL上机分析。

1.4 色谱质谱条件

1.4.1 色谱条件

Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱；柱温：40℃；流动相A为0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)，流动相B为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱条件见表1。

表1 超高效液相色谱分离条件

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源离子模式(ESI+)扫描，多反应监测模式(MRM)测定；毛细管高压为4.5 k V，离子源温度为500℃，雾化气：1.5 L/min，去溶剂气：15 L/min，反吹气：1.0 L/min，碰撞气：0.46 m L/min。化合物相关质谱参数表2。

表2 15种常见安眠镇静药物保留时间和检验参数

2、结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

首先，将15种常见安眠镇静药物混合标准品溶液分别对有机相甲醇和乙腈，水相纯水和添加0.05%、0.1%、0.2%甲酸水进行试验，结果表明15种常见安眠镇静药物的灵敏度在以甲醇为有机相对比以乙腈为有机相时更低，主要原因是使用甲醇为有机相进行分离15种常见安眠镇静药物本地基线较乙腈高，于是选择乙腈为流动相有机相。其次，考察水相流动相，以纯水水相流动相时出现明显拖尾现象，在以0.05%、0.1%、0.2%甲酸水为水相流动相时，0.05%甲酸水与0.1%和0.2%甲酸水为水相流动相时响应相低，这可能是因为增加甲酸浓度提高了离子化效率；0.1%和0.2%甲酸水为水相流动相时响应相差不大，选择0.1%甲酸水为水相流动相。最后，为了增加流动相的稳定性和优化峰形，在0.1%甲酸水中加入可挥发性盐甲酸铵，使其浓度为5 mmol/L。图1为10 ng/mL的15种常见安眠镇静药物混合标准溶液提取离子流图。

图1 15种常见安眠镇静药物混合标准溶液提取离子流图

2.2 质谱条件的优化

通过1.2中单标准工作液配制浓度为100 ng/mL的15种常见安眠镇静药物单一标准品溶液，分别在ESI正和负离子2种模式下使用Full Scan模式获得化合物母离子；在Production模式选取干扰小且响应较高的2个子离子；设置MRM质谱方法，从5 V开始，以5 V为步长逐步递增进一步在MRM模式优化碰撞能，最终确定15种常见安眠镇静药物最优质谱参数见表2。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法专属性

取10份不同空白血液分别经过1.3样品前处理后，进行上机分析，考察血液基质中对目标物是否存在干扰情况。结果表明，在空白血液基质中，并未出现15种常见安眠镇静药物相关色谱峰，这说明本方法具有较高专属性。

2.3.2 线性范围、检出限和定量限

空白血液经过1.3处理过得到的空白血液基质提取液，使用空白血液基质提取液配制1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL系列浓度15种常见安眠镇静药物混合标准品基质添加样品，每个添加浓度平行3份，上机进行检验分析。以目标物基质加标绝对质量为横坐标(x,ng/mL)，峰面积纵坐标(y)，拟合线性回归方程见表3。结果表明，血液中15种常见安眠镇静药物在1 ng/mL～50 ng/mL范围内R2均大于0.9979，线性关系良好。以S/N≥3∶1作为检出限，S/N≥10∶1作为定量限，本方法血液中15种常见安眠镇静药物检出限在0.08 ng/mL～0.29 ng/mL之间，定量限在0.25 ng/mL～0.96 ng/mL之间。

表3 15种常见安眠镇静药物线性方程、R2和检出限

2.3.3 基质效应

首先通过对空白血液进行提取得到空白血液基质提取液，并用其配制浓度为2 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL基质加标溶液，测定峰面积为ME1，用乙腈溶剂配制浓度为0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL标准品溶液，测定峰面积为ME2。通过峰面积比值ME1/ME2(%)评价基质效，结果见表4。结果表明，15种常见安眠镇静药物在低、中、高三种浓度时，基质效应在81.06%～100.72%之间，未见明显基质效应。

2.3.4 回收率和精密度

在低、中、高三种浓度(2 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)水平上添加15种常见安眠镇静药物混合标准品，平行制备6份样品，按照1.2进行样品前处理后上机分析，回收率见表4。每个浓度平行测定6次。每日早、中、晚各分析测定6次，计算回收率，并计算峰面积相对标准差(RSD)，得到日内精密度，连续测定3天，获得日间精密度见表4。结果表明15种常见安眠镇静药物在血液中提取回收率在76.86%～102.0%之间，日内、日间精密度RSD均不大于7.68%。表明本方法具有较好的提取回收率和精密度。

表4 15种常见安眠镇静药物回收率和精密度

3、应用案例

2024年1月，受理一起安眠药中毒案件，送检血液为案发后15小时抽取。按照本文建立方法进行检验，通过分析中毒者血液，结果表明其血液中氯硝西泮含量为176.39 ng/mL，为案件侦破提供了支持。

4、结论

本文以在司法检验鉴定实践过程中常见的15种常见安眠镇静药物为检验目标物，以血液为检材，采用简单高效的乙腈沉淀蛋白法进行前处理，建立了一种超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱快速测定血液中15种常见安眠镇静药物的方法。本方法操作简单便捷，专属性好，灵敏度高，准确性好，为司法鉴定机构和医院在实际工作中对15种常见安眠镇静药物中毒血液检验提供参考方法与技术支持。

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