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五味子酯乙靶向PTGS1抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮间质转化

2025-01-13 102 上传者：管理员

摘要：目的分析五味子酯乙靶向前列腺素内过氧化物合酶1 (prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)抑制子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC)细胞增殖和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的机制。方法 Target Net预测五味子酯乙的靶点PTGS1, TCGA数据库分析UCEC中高表达基因PTGS1与临床病理特征的关系。设置对照组、五味子酯乙组和sh-PTGS1组,检测各组细胞生存率、克隆细胞数和细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、 Vimentin、 N-cadherin、 Snail)表达情况。观察PTGS1对移植瘤体积、重量,和增殖指数(Ki67)表达的影响。构建稳定过表达PTGS1的Ishikawa和HEC108细胞,检测五味子酯乙对过表达PTGS1的Ishikawa和HEC108细胞存活情况、克隆细胞数和EMT蛋白表达的影响。结果与对照组比较, sh-PTGS1组和五味子酯乙组中细胞增殖和细胞克隆数以及PTGS1、 Vimentin、 N-cadherin、 Snail表达明显下降, E-cadherin表达明显上升(P<0.05); sh-PTGS1组移植瘤模型中移植瘤组织体积、质量和Ki67表达水平均明显降低(P<0.05); PTGS1过表达组细胞中E-cadherin明显下降, Vimentin、 N-cadherin、 Snail、 PTGS1表达水平, Ishikawa和HEC108细胞活性和克隆细胞数明显上升(P<0.05)。与五味子酯乙组比较,五味子酯乙+PTGS1过表达组E-cadherin明显下降, Vimentin、 N-cadherin、 Snail、 PTGS1明显上升(P<0.05)。结论五味子酯乙可能通过靶向PTGS1,下调PTGS1表达水平,抑制UCEC增殖和EMT发生。

关键词：
上皮间质转化
五味子酯乙
前列腺素内过氧化物合酶1
子宫内膜癌
细胞增殖
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子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)是好发于中老年女性的上皮性恶性肿瘤,目前UCEC的治疗手段多样化,为患者提供较多选择[1-2]。尽管对于大部分UCEC患者来说,行子宫切除术然后根据最终病理结果行术后放化疗是目前的规范化治疗方案,但由于个体差异大,并且手术治疗的方式对患者生育功能影响较大,放疗化疗过程较为痛苦,临床仍在不断探索UCEC的其它治疗途径,并不断经体外模型筛选出效果确切的药物[3-4]。五味子酯乙提取自五味子,对肝脏、消化道及中枢神经系统均具有药理活性[5]。近年的体外肿瘤细胞抑制性实验结果显示[6-7],五味子酯乙的抗肿瘤活性与其含有的总木脂素成分有关,在人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep G2和人食管癌细胞系9706中,均被观察到可发挥良好的肿瘤抑制作用。因此,五味子酯乙作为治疗多种肿瘤的潜在药物,受到了研究者们的广泛关注,本研究分析了五味子酯乙对UCEC的机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1药品和仪器

CO2培养箱(赛默飞)、全自动酶标仪(赛默飞)、显微镜(奥林巴斯);人UCEC Ishikawa细胞(博湖生物科技),HEC108细胞(科瑞思搏生物科技);五味子酯乙(Schisantherin B)由本院提供;RPMI-1640培养基(20200115,益普生物科技)、FBS (20200214,益普生物科技)、质量分数4%的多聚甲醛(20191227,益普生物科技);CCK-8检测试剂盒(20190427,上海经科化学科技)和1%结晶紫溶液(20190918,上海经科化学科技);链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotinpcroxidase complex method,ABC)试剂盒(20190324,百奥莱博科技);HRP标记兔抗鼠二抗(ab6728,Abcam),钙黏蛋白(E-cadherin)(ab241676,Abcam)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)(ab18203,Abcam)、波形蛋白(Vimentin)(ab223871,Abcam)、螺旋转录因子基因(snail family transcriptional repressor 1,Snail)(ab307571,Abcam)、前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)(ab270477,Abcam)。sh NC (优宝公司)、sh PTGS1 1#(优宝公司)、sh PTGS1 2#(优宝公司)、pc DNA-3.0(优宝公司)以及PTGS1质粒(优宝公司)。

1.1.2实验动物

BALC/c裸鼠18只,5～7周龄,均为雌性,重约20 g,由河北省实验动物中心提供,许可证号:生产许可SCXK (冀) 2022-001。

1.2五味子酯乙靶向PTGS1分析

下载TCGA中UCEC表达数据和临床对应信息,分析PTGS1水平与UCEC临床表型关系。GSEA分析PTGS1与UCEC恶性生物学行为的关系。Target Net(取pro>0)预测PTGS1为五味子酯乙的靶点之一。

1.3细胞培养及处理

采用含质量分数10%FBS的RPMI-1640培养液室温下培养Ishikawa和HEC108细胞,隔天换液。sh PTGS1 1#组敲低其PTGS1,空白质粒为sh NC组。观察Ishikawa和HEC108细胞生长情况;另取一部分培养的Ishikawa和HEC108细胞,分别加入不同浓度的五味子酯乙,5%CO2培养箱中培养24 h (条件为37℃、p H7.0～7.2),观察五味子酯乙对Ishikawa和HEC108细胞的IC50和细胞生长情况。

1.4细胞增殖

采用CCK-8法,根据试剂盒操作检测各组细胞增殖,450 nm下测量吸光度。连续观察5 d,绘制生长曲线。

1.5克隆形成实验

接种细胞、孵育和培养处理方法同方法1.4,待克隆生长到合适大小后,室温固定、染色,观察每细胞克隆数。

1.6裸鼠移植瘤实验

SPF条件下,于9只雌性裸鼠左前肢近腋窝处皮下注射空白质粒处理的HEC108细胞株(8×106个/m L) 0.2 m L,另9只同样部位注射采用PTGS1-sh RNA质粒处理的HEC108细胞株(8×106个/m L) 0.2 m L,构建人UCEC裸鼠皮下移植瘤模型,两组注射等量生理盐水,每隔1天测量体积,第14天处死全部裸鼠后称质量。

1.7免疫组化法检测移植瘤组织中细胞增殖核抗原(Ki67)表达

取两组裸鼠移植瘤组织,按常规方法进行固定并制作切片,Ki67免疫组化染色后,利用ImagePro Plus图像分析系统分析,计算阳性细胞率。

1.8上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

取药物处理后Ishikawa和HEC108细胞,采用蛋白质印迹检测上皮性标记蛋白E-cadherin、间充质标记蛋白N-cadherin、Vimentin和Snail的表达水平。

1.9构建过表达PTGS1细胞

通过Lipofectamin2000,将携带PTGS1编码序列的质粒和空白质粒转染至Ishikawa和HEC108细胞中,转染时间为24 h,使用G418筛选2周,蛋白质印迹实验(Western blot,WB)验证。将过表达细胞分为对照组、五味子酯乙组、PTGS1过表达组和五味子酯乙+PTGS1过表达组(五味子酯浓度均为IC50),于5%CO2培养箱中培养24 h (培养条件:37℃p H 7.0)。

1.10蛋白质印迹检测EMT标记物的表达

取处理后过表达Ishikawa和HEC108细胞,弃培养液,裂解释放提取蛋白,电泳,转膜,室温下封闭,2 h后加一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和PTGS1),4℃孵育过夜,使用缓冲液多次洗涤膜后加二抗,孵育1 h。化学发光显影,β-actin为内参,使用软件进行图像分析,量化条带强度,确定E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和PTGS1等目标蛋白的相对表达量。

1.11统计学处理

采用SPSS 17.0对收集的研究数据进行分析,得到相应的统计学结果。本研究中计量资料呈正态分布的以表示,组间差异的统计学方法为单因素方差分析,条件不满足的则采用四分位数表示,组间差异的统计学方法为非参数检验;组内多个时间点的比较方法为重复测量方差分析。

2、结果

2.1 PTGS1与子宫内膜癌临床病理特征的关系

下载TCGA子宫内膜癌表达数据和临床对应信息,发现PTGS1在子宫内膜癌中高表达,且与分级及复发相关。以子宫内膜癌中PTGS1表达水平中位数分组,将子宫内膜癌患者分为PTGS1高/低两组,GSEA分析结果表明,在子宫内膜癌中,PTGS1与细胞增殖、迁移、侵袭和EMT相关(图1)。

图1 PTGS1与子宫内膜癌临床病理特征的关系

2.2低表达PTGS1抑制UCEC细胞增殖和EMT

sh PTGS1 1#组、sh PTGS1 2#组PTGS1、细胞生长率、克隆细胞数、Vimentin、N-cadherin、Snail低于sh NC组,E-cadherin高于sh NC组(P<0.05)(图2)。

图2低表达PTGS1抑制UCEC细胞增殖和EMT

2.3低表达PTGS1在体内抑制UCEC增殖

各时间点sh PTGS1 1#组瘤体体积均明显较小(P<0.05);sh PTGS1 1#组移植瘤质量和Ki67水平均明显小于sh NC组(P<0.05)(图3)。

图3低表达PTGS1在体内抑制UCEC细胞增殖

2.4五味子酯乙抑制Ishikawa和HEC108细胞增殖

Target Net预测五味子酯乙靶点,得到94个靶点(pro>0)。CCK-8实验结果显示,五味子酯乙对Ishikawa和HEC108细胞的IC50分别是45.51μmol/L和42.84μmol/L,因此后续Ishikawa和HEC108细胞分别用45μmol/L和40μmol/L的浓度做功能实验。五味子酯乙组细胞生长率、克隆细胞数明显降低(P<0.05)(图4)。

2.5五味子酯乙通过PTGS1抑制UCEC细胞增殖

五味子酯乙能够抑制PTGS1表达,且具有时间和浓度依赖性(P<0.05)。构建稳定过表达PTGS1的Ishikawa和HEC108细胞系,进行蛋白质印迹检测,结果发现,五味子酯乙组E-cadherin最高,Vimentin、N-cadherin、Snail、PTGS1、细胞活性和克隆细胞数最低,PTGS1过表达组E-cadherin最低,Vimentin、N-cadherin、Snail、PTGS1、细胞活性和克隆细胞数最高,五味子酯乙+PTGS1过表达组介于二者之间(P<0.05)(图5)。

图5五味子酯乙通过PTGS1抑制UCEC细胞增殖

3、讨论

UCEC发生的原因迄今尚不明确,与生活方式等密切相关,多数肿瘤生长缓慢,局限于内膜或宫腔内时间较长[8]。TCGA数据库结果显示PTGS1在UCEC中高表达,且与分级及复发相关。GSEA分析结果表明,PTGS1与UCEC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT相关。本研究体外实验结果显示敲低PTGS1的细胞株中PTGS1表达水平,UCEC肿瘤细胞增殖和克隆细胞数明显降低;体内实验显示,敲低PTGS1基因后,移植瘤组织体积和质量增长水平、移植瘤组织中Ki67蛋白表达水平均明显小于对照组,该结果说明PTGS1基因表达水平降低后,UCEC细胞生存率下降,靶向该基因有望控制UCEC细胞恶性增殖。Ki67存在于细胞周期的所有活跃阶段,通过检测其表达量可评估肿瘤的增殖活性,本研究中,PTGS1表达被抑制后,Ki67阳性率明显降低,说明抑制PTGS1表达可以抑制UCEC癌细胞恶性增殖。蛋白质印迹显示,敲低PTGS1后,E-cadherin升高,Vimentin、N-cadherin、Snail表达水平明显下降,说明下调PTGS1表达,可以阻碍肿瘤细胞的EMT进程。

既往研究表明,五味子酯乙有抗肿瘤的作用,并展示出高效的肿瘤多药耐药逆转作用[9-10]。构建稳定过表达PTGS1的Ishikawa和HEC108细胞系,发现与对照组比较,PTGS1过表达组UCEC细胞生存率明显上升,但加入五味子酯乙后,UCEC细胞活性和克隆细胞数明显下降,说明PTGS1表达水平与肿瘤细胞活性有关,其能够促进UCEC细胞恶性增殖,而五味子酯乙可以逆转因PTGS1高表达引起的肿瘤细胞增殖的现象,这可能是因为五味子酯乙的木脂素成分可以通过调节与肿瘤生长和凋亡相关的基因表达,发挥抗肿瘤的作用,猜测五味子酯乙通过作用于特定靶点,抑制相关基因的表达,从而发挥抑制肿瘤恶性增殖的生理作用。本研究发现与五味子酯乙组比较,五味子酯乙+PTGS1组细胞活性和克隆细胞数明显上升,说明PTGS1过表达可以逆转五味子酯乙对UCEC细胞增殖的抑制作用。

EMT是癌细胞迁移和侵袭的生理基础,上皮细胞完成向间质细胞的转换过程后,失去了与基底膜的连接,从而具备了较高的转移能力和抗凋亡特性[11]。在EMT过程中可发现E-cadherin表达减少、N-cadherin表达增加、细胞骨架转变为Vimentin为主等现象[12-14]。有研究证明,五味子酯具有抑制癌细胞侵袭、转移的活性,这可能是通过作用于EMT过程[14]。本研究结果显示,PTGS1过表达组E-cadherin表达明显下降,Vimentin、N-cadherin、Snail、PTGS1表达明显上升,而五味子酯乙组的变化趋势与之相反,提示五味子酯乙可能通过下调PTGS1表达水平降低EMT标志物表达水平,从而抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为,使其发生转移的难度增大,而过表达的PTGS1可以逆转五味子酯乙的抑癌作用。

综上所述,五味子酯乙可能通过下调PTGS1表达水平,抑制UCEC细胞增殖和EMT。

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基金资助:河北省卫生健康委科研基金(No.20191730);河北省2022年度医学科学研究课题(No.20221905)~~;

文章来源:叶晶,李萍,赵金荣,等.五味子酯乙靶向PTGS1抑制子宫内膜癌细胞增殖和上皮间质转化[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):23-28.