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莪术醇通过调控巨噬细胞功能治疗小鼠子宫内膜异位症的机制研究

2021-09-14 170 上传者：管理员

摘要：：目的探究莪术醇治疗小鼠子宫内膜异位症的效果和作用机制。方法通过腹腔移植法构建小鼠子宫内膜异位症模型,随机分成模型组和治疗组各6只,正常小鼠作为对照组(6只)。分别灌胃给相应药物,每天1次。每天监测小鼠状态,并测量体重。4周后,观察腹腔粘连情况,异位病灶体积,腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1含量。流式细胞术检测CD36、MMP9、CD206、IkB-α、NF-κB、p65的表达水平。结果莪术醇、减轻腹腔粘连情况、减少异位病灶的体积(P<0.001)。莪术醇下调炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌水平(P<0.01),上调CD36和MMP9的表达(P<0.01),减少CD206的表达(P<0.001)。莪术醇导致IkB-α表达量显著升高(P<0.001),p65表达量受到抑制(P<0.01)。结论莪术醇缓解子宫内膜异位症的病程,可能是通过抑制NF-κB的活化来调控巨噬细胞功能。

关键词：
子宫内膜异位症;
巨噬细胞
效果
莪术醇
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子宫内膜异位症（endometriosis,EMs），是临床常见的妇科慢性疾病，发病率占育龄期女性的10%～15%[1,2]。但是，EMs确切的发病机制目前仍不是十分清楚。随着研究的深入，巨噬细胞参与了EMs的发生和发展，是EMs免疫治疗的重要靶标之一[3]。莪术醇是临床治疗内异症常用中药之一。本研究通过探究莪术醇治疗EMs的作用，从莪术醇调控巨噬细胞功能角度对莪术醇的治疗机制进行探讨，以期能够为临床治疗提供更为准确有力的理论支持。

一、材料与方法

1.主要实验试剂：莪术醇（CAS号：4871-97-0）购于上海吉至生化科技有限公司；苯甲酸β-雌二醇（CAS号：50-50-0）、DNaseI(CAS号：9003-98-9）购自SigmaAldrich公司；PBS、RPMI1640购于Hyclone公司；胶原酶IV购于Gibco公司；BSA、红细胞裂解液购于Biosharp公司；荧光标记抗小鼠CD11b、F4/80、CD36、MMP9、CD206、IkB-α、NF-κBp65抗体购于BioLegend公司；核内转录因子染色试剂盒、小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1ELISA检测试剂盒购自上海优宁维公司。

2.实验动物：SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6周龄，24只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，使用许可证：SYXK（京）2019-0022。饲养温度25℃，湿度50%。实验动物使用伦理审批号IACUC为：201900307-23。

3.子宫内膜异位症造模、分组与治疗：造模前1周雌二醇灌胃，0.5mg/kg/7d，第8天移植。将子宫剪碎。1个子宫移植至2只的腹腔内。移植后雌二醇0.5mg/kg/5d。3周后有明显内异病灶。分成模型组、治疗组和对照组，每组6只。治疗组，莪术醇溶液，30mg/kg；对照组和模型组等体积生理盐水。每天灌胃给药1次，连续4周监测体重变化。

4.腹腔灌洗液细胞因子、异位病灶及相关检测：治疗结束后，收集腹腔清洗液，采用ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1浓度。观察异位病灶和小鼠盆腔粘连情况，计算各组异位病灶的体积。使用酶消化法制备子宫内膜组织单细胞悬液，取1×106细胞（100μl）加入适量抗体，4℃避光孵育30min。细胞破膜后分别加入抗小鼠抗体。重悬后流式细胞仪检测巨噬细胞蛋白的表达量。

5.统计学方法：采用SPSS22.0软件进行统计分析，实验数据均采用平均数±标准差（mean±SD）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析（OneWayANOVA）法分析，进一步采用最小显著性差异法（LSD法）进行多重两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.莪术醇对小鼠无明显毒性：结果显示，使用莪术醇治疗的过程中，没有小鼠死亡，其生理活动正常，治疗组毛色较模型组光泽，但是比对照组稍暗淡些。治疗结束后，各组体重没有显著性差异，说明本实验中所使用的莪术醇剂量对小鼠没有产生明显的毒性反应。

2.莪术醇缓解小鼠子宫内膜异位症症状：治疗结束后，观察到对照组无异位病灶。模型组异位病灶呈单个或者多房葡萄状囊泡，颜色偏暗，质硬，表面有结缔组织和小血管，部分有粘连。而治疗组异位病灶较模型组小，多为单个囊泡状，颜色偏淡，质稍软，表面可见细小血管，偶尔有粘连，易分离。对粘连情况进行评分，计算了异位病灶的体积，结果表明，治疗后，小鼠腹腔粘连评分下降（P<0.05），粘连明显好转；而且治疗组异位病灶体积小于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3.莪术醇降低子宫内膜异位症小鼠腹腔炎症细胞因子：与对照组比较，模型组和治疗组小鼠腹腔液中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量均明显升高（P<0.05）。经莪术醇灌胃治疗后，治疗组相较于模型组小鼠，其腹腔液中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量均有不同程度的下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1各组小鼠腹腔液中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量比较

4.莪术醇改变子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞功能：为了研究莪术醇的作用机制，我们对异位病灶的巨噬细胞进行研究。相较于对照组，模型组小鼠异位病灶巨噬细胞的CD36、MMP9的表达量受到抑制，而经过莪术醇治疗后，CD36和MMP9的表达量显著升高（P<0.05）。与对照组比较，模型组巨噬细胞高表达M2表型markerCD206，而治疗组CD206表达量明显降低（P<0.05）。

5.莪术醇抑制巨噬细胞NF-κB活化：相较于对照组，模型组巨噬细胞IkB-α表达降低、NF-κBp65亚基表达量明显升高（P<0.05），说明NF-κB通路已经被激活。而经过莪术醇治疗后，巨噬细胞的IkB-α表达量显著升高，而NF-κBp65亚基表达量则被抑制（P<0.05），说明莪术醇能够抑制巨噬细胞NF-κB活化（P<0.05），从而抑制巨噬细胞炎症反应，缓解小鼠子宫内膜异位症。

三、讨论

对于EMs的发病机制有许多理论，其中机体的免疫失调和局部炎症反应可能在EMs的发生发展中起着重要作用[3]。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在EMs患者腹腔和异位内膜组织上均能检测到大量的巨噬细胞，其在EMs的发生发展过程中起到重要作用[4]。在正常生理状态下，当子宫内膜组织逆行进入腹腔时，巨噬细胞会识别这些异位内膜组织并清除，同时分泌炎症因子维持腹腔微环境的稳态[5]。由于EMs患者异常的腹腔免疫反应，其会存在高浓度的前列腺素E2(PGE2），使得异位内膜组织更易于存活。本研究的数据也证实了这一结果，在子宫内膜异位症模型小鼠异位内膜组织中的巨噬细胞，其MMP-9和CD36的表达量明显下降，而且小鼠腹腔中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1均比对照组的分泌量显著升高。腹腔中激活的巨噬细胞释放IL-1β和TNF-α，有助于异位内膜细胞的浸润、黏附和增殖[6]。同时，巨噬细胞分泌过量的IL-6，抑制自然杀伤细胞穿孔素和颗粒酶B的表达，有助于与内膜细胞的存活和增殖。而且，异位内膜组织招募更多的游离巨噬细胞，进一步加速炎症反应进展，利于异位内膜种植。此外，在腹腔中高PGE2的环境下，巨噬细胞会极化成为M2表型，高表达VEGF、纤维连接蛋白、TGF-β等，加速了EMs的病程。

中医认为瘀血与炎症有一定的相关性[7]，莪术是中医临床治疗EMs常用药物，具有活血化瘀之效，其主要成分莪术醇有抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等功效[8]，因此探究其在治疗EMs过程中的具体分子机制为新药物的筛选提供依据。我们研究了莪术醇对在巨噬细胞炎症反应中起关键作用的NF-κB的作用，结果表明，莪术醇能够抑制IkB-α的降解，下调p65亚基的表达，抑制NF-κB的活化，从而影响巨噬细胞的功能。本研究主要在小鼠动物模型中，从巨噬细胞功能的角度，探究了莪术醇治疗子宫内膜异位症的机制，是否能为莪术的临床治疗提供更多有利的理论支持仍需要进行大量的实验验证。

文章来源：田滢舟,曹立幸,具春花,陈颐.莪术醇通过调控巨噬细胞功能治疗小鼠子宫内膜异位症的机制研究[J].中国妇产科临床杂志,2021,22(05):544-545.