摘要:目的:该实验通过五味消毒饮水煎液的特征图谱结合其有效成分秦皮乙素、绿原酸的含量及出膏率考察其制备工艺。方法:遵循传统煎煮方法结合现代分析方法,以五味消毒饮水煎液的特征图谱、有效成分绿原酸、秦皮乙素含量及出膏率为指标对煎煮过程中参数进行考察,包括粉碎粒度、煎器、加热方式、滤材、不同浓缩温度、不同浓缩密度、干燥方式等,并确定最佳工艺。制备15批五味消毒饮物质基准,建立五味消毒饮物质基准的特征图谱,进行共有峰的归属、指认及相似度评价。结果:确定五味消毒饮物质基准的制备工艺:取处方量药材饮片,置1.8 L砂锅中,加水400 mL,用电陶炉作为热源,先武火加热至沸,后文火煎至160 mL,加入黄酒100 mL,再滚二三沸时(沸腾后离火,不沸后再加热,重复3次),以200目滤布滤过;药渣同法再煎煮1次。合并2次煎液,60~65℃下减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60℃),放冷,预冻至结冰,冷冻干燥,研细,混匀,即得。五味消毒饮物质基准供试品特征图谱中应有8个特征峰,并指认了其中7个峰。8个峰涵盖了五味消毒饮物质基准中的所有药味,较好表明了五味消毒饮物质基准的质量特性。结论:五味消毒饮物质基准的制备工艺,稳定可行,为五味消毒饮及其相关制剂的开发奠定了基础。
五味消毒饮最早载于清代《医宗金鉴》,具有清热解毒、凉血消肿等功效[1]。现代药理研究表明,其具有广谱抗细菌、真菌、病毒、肿瘤的作用,并对细菌有耐药性低、抗炎、调节免疫的功效[2,3,4]。五味消毒饮于临床用于外科感染所致的红、肿、热、痛,用于皮肤科治疗,主要对带状疱疹、痤疮、湿疹、皮痒等具有良好的治疗效果[5,6]。
国家食品药品监督管理总局(CFDA) 于 2008 年发布了《中药注册管理补充规定》[7](简称补充规定),对于经典名方的研发进入了如火如荼的状态,给中药行业的发展带来了希望。物质基准是以古代医籍所记载制备工艺为依据所制备的中药药用物质标准。除成型工艺外,其余制备方法应与古代医籍记载基本一致。以期作为经典名方质量控制的基准,也是衡量制剂与中医临床所使用的药用物质是否一致的标准[8,9]。目前对于经典名方五味消毒饮的研究主要集中在成分质量标准的建立、特征图谱等方面[10,11,12],而对于制备工艺的研究较少。
本课题组前期经过对五味消毒饮的大量文献考证,最终确定所用药材的基源、产地、炮制,考证其所用计量及加水量等,以保证五味消毒饮物质基准制备过程的科学性与合理性。本实验遵循古代煎煮工艺并结合现代制药设备及方法进行制备工艺的研究,通过对五味消毒饮煎煮、浓缩、干燥等工艺考察,确定基本工艺参数,为经典名方五味消毒饮质量标准的研究奠定了基础。
1、材料
高效液相色谱仪,LC-2030,日本岛津公司。绿原酸对照品(110807-200205)、木犀草苷对照品(110715-200815)、蒙花苷对照品(110708-200505)、秦皮乙素对照品(10172-080114)购自于中国食品药品检定研究院。水为纯化水。
五味消毒饮的饮片均购自于3个产地,金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。野菊花为菊科植物野菊Ghrysanthemum indicum L.的干燥头状花序,蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacummongolicum Hand.-Mazz.、碱地蒲公英Tarxacumborealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草,紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草,天葵子为毛茛科植物天葵Semiaquilegia adoxoides(DC.)Makino的干燥块根。
五味消毒饮所用饮片按照2020版《中华人民共和国药典》进行检查,均符合要求。产地信息见表1。
表1 五味消毒饮15批物质基准各饮片产地信息
2、方法与结果
2.1 物质基准的制备
金银花11.19 g、野菊花4.48 g、蒲公英4.48 g、紫花地丁4.48 g、天葵子4.48 g, 加水400 mL,武火加热至沸,后文火保持微沸煎至160 mL,加入黄酒100 mL,再滚二三沸时(沸腾后离火,不沸后再加热,重复3次),以200目滤布滤过;药渣同法再煎煮1次。合并两次煎液,减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60 ℃),放冷,预冻至结冰,冷冻干燥,研细,混匀,即得。
2.2 煎液中各成分含量测定
2.2.1 秦皮乙素的含量测定
色谱条件:Inertsil®ODS-SP(4.6 mm×250 mm),检测波长为344 nm, 流动相为乙腈-0.1%磷酸(15∶85),柱温:30 ℃,流速:1.0 mL/min, 进样体积为10 μL。
对照品溶液的制备:取秦皮乙素对照品适量,加甲醇制成30 μg/mL的秦皮乙素对照品溶液。
煎液供试品溶液的制备:精密量取各煎液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
浓缩液供试品溶液的制备:将浓缩液稀释至与煎液相同体积,精密量取稀释液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
干燥粉供试品溶液的制备:取本品,研细,取约0.5 g, 精密称定,置圆锥底烧瓶中,精密加甲醇25 mL,称定质量,加热回流处理30 min, 放冷,再称定质量,以甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.2 绿原酸的含量测定
色谱条件:Inertsil®ODS-SP (4.6 mm×250 mm),检测波长为327 nm, 流动相为乙腈-0.4%磷酸(13∶87),柱温:30 ℃,流速:1.0 mL/min, 进样体积为10 μL。
对照品溶液的制备:取绿原酸对照品适量,加甲醇制成50 μg/mL的对照品溶液。
煎液供试品溶液的制备:精密量取各煎液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
浓缩液供试品溶液的制备:将浓缩液稀释至与煎液相同体积,精密量取稀释液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
干燥粉供试品溶液的制备:取本品,研细,取约0.5 g, 精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇100 mL,称定质量,超声处理(功率250 W,频率50 kHz)30 min, 放冷,再称定质量,以50%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3 五味消毒饮出膏率的计算
五味消毒饮平行2份煎煮,所得水煎液水浴蒸干,105 ℃干燥箱干燥至恒重,减重法称量得到五味消毒饮全方干膏,计算出膏率:出膏率=干膏质量/处方量×100%。
2.4 五味消毒饮特征图谱的测定
色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相B,以0.5%磷酸为流动相A,按下表中规定的梯度进行洗脱;检测波长为320 nm; 柱温25 ℃,进样体积为10 μL。
表2 梯度洗脱表
对照品溶液的制备:取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、秦皮乙素、咖啡酸、蒙花苷对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中加75%甲醇分别制成每1 mL含200、50、44、40、20、15、10 μg的混合对照品溶液,即得。
煎液供试样品的制备:精密量取煎液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
浓缩液供试品溶液的制备:将浓缩液稀释至与煎液相同体积,精密量取稀释液5 mL置10 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,即得。
干燥粉供试品溶液的制备:取本品,研细,取约0.5 g, 精密称定,置锥形瓶中,精密加甲醇25 mL,称定质量,超声处理30 min, 放冷,再称定质量,以甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3、煎煮工艺考察及结果
3.1 粉碎粒度考察
按方中配比分别称取5味药材饮片(粗粉、麻豆大小、饮片),置砂锅中,加水400 mL,置电陶炉上,武火煎煮至沸腾,改用文火保持微沸,煎至160 mL,加入黄酒100 mL,再滚二三沸时,以200目滤布滤过;药渣同法再煎煮1次。按上述方法处理进样,采用综合评分法对考察指标进行赋分,筛选五味消毒饮煎煮最佳粒度[13]。计算公式为:综合得分0.4*X1/X1max+0.4*X2/X2max+0.2*Y/Ymax,X1~X2分别为秦皮乙素、绿原酸,Y为出膏率。结果见表3与图1。
表3 不同粉碎度考察结果 (n=3)
图1 不同粉碎度的影响
结果表明,不同药材粒度投料的煎煮效果有所差异。粗粉投料煎煮,秦皮乙素及绿原酸的含量较低,分析原因为药材粒度小,有效成分容易煎出,在煎液中长时间煎煮导致了成分的损失,但得膏量较多;而饮片及麻豆大小投料,秦皮乙素、绿原酸的转移率较高。由图1结果可知,各煎液特征图谱显示,主要成分基本一致。运用综合评分可知:麻豆大小药材综合评分最高,故本品选择以麻豆大小药材进行煎煮。
3.2 热源考察
分别取1倍处方量药材(麻豆大小),加水400 mL,置煤气炉、电陶炉、电阻炉煎煮,煎至160 mL,加黄酒100 mL,再煮三沸后用200目纱布滤过;同法再煎煮1次,合并滤液。按上述方法处理进样,结果见表4与图2。
表4 不同热源考察结果 (n=3)
图2 不同热源考察特征图谱
由图2结果可知,各煎液特征图谱显示,主要成分基本一致。综合指标成分含量及出膏率结果分析:以煤气炉、电陶炉及电阻炉作为热源,得膏量相当。电陶炉与煤气炉煎煮时间及煎液中秦皮乙素的含量基本一致;电阻炉煎煮的绿原酸含量较高,可能是由于煎煮时间较长。同时,鉴于煤气炉及电阻炉的功率(火候)无法控制,而电陶炉则有明确的加热功率,为保证后续重复性实验的准确,选择带有功率指示的电陶炉作为本品的加热源。
3.3 煎器考察
分别取1倍处方量药材(麻豆大小),加水400 mL,置不锈钢锅、砂锅、1.8 L砂锅、3.0 L砂锅,煎至160 mL,加黄酒100 mL,再煮三沸后用200目纱布滤过;同法再煎煮1次,合并滤液。按上述方法处理进样,采用综合评分法进行优选,结果见表5与图3。
表5 不同煎器考察结果 (n=4)
图3 不同煎器考察
由图3结果可知,各煎液特征图谱显示,主要成分基本一致。运用综合的评分可知:1.8 L砂锅所评分最高,另结合古代经典名方使用历史,古代均采用砂锅煎煮,故本品选择以1.8 L砂锅作为煎煮器具。
3.4 煎煮器具及热源的考察
分别取1倍处方量药材(麻豆大小),加水400 mL,分别用电陶炉+砂锅(1.8 L,下同)和电磁炉+不锈钢锅的方式煎煮,煎至160 mL,加黄酒100 mL,再煮三沸后用200目纱布滤过;同法再煎煮1次,合并滤液。按上述方法处理进样,比较不同煎煮方式对指标成分及特征图谱的影响,并采用综合评分法进行优选,结果见表6与图4。
表6 不同煎煮方式结果 (n=3)
图4 不同煎煮方式特征图谱
由图4结果可知,各煎液特征图谱显示,主要成分基本一致。运用综合的评分可知:电陶炉+砂锅所评分最高。故选择电陶炉+砂锅进行煎煮考察。
3.5 滤过材质的考察
取1倍量处方药材(麻豆大小),置砂锅中,加水400 mL,以电陶炉武火加热至沸腾,调文火煎至160 mL,加黄酒100 mL,再煮三沸后滤过;同法再煎煮一次,合并滤液。分别考察滤布(200目、300目)、绢布的过滤效果。按上述方法处理进样,比较不同滤材对指标成分及特征图谱的影响,采用综合评分法进行优选,结果见表7与图5。
表7 不同材质的滤过效果 (n=3)
图5 不同材质的滤过样品特征图谱
由图5结果可知,各煎液特征图谱显示,主要成分基本一致。200目滤布综合评分最高,故采用200目滤布过滤。
4、浓缩、干燥工艺考察
4.1 浓缩温度的考察
按优选工艺制备五味消毒饮的物质基准,制备4份溶液。分别在55、60、65、70 ℃进行减压浓缩至1/3。按“2.2”项下浓缩液指标成分含量测定及“2.4”项下特征图谱的测定方法制备供试样品并进行检测,比较不同浓缩温度对指标成分及特征图谱的影响。结果见表8与图6。
表8 浓缩温度考察 (n=4)
图6 浓缩温度样品特征图谱
由图6可知不同浓缩温度样品特征图谱显示,主要成分基本一致。由表8实验结果可知55~70 ℃均能实现浓缩,随着浓缩温度的提高,浓缩耗时逐渐减少;4个浓缩温度下所得浓缩液的颜色一致;当浓缩为60 ℃时,2个指标成分的含量最高,其他温度稍低。综合考虑,最优浓缩温度为60~65 ℃。
4.2 浓缩密度考察
按优选工艺制备五味消毒饮的物质基准,平行煎煮4份,以隔膜泵50~60 ℃浓缩,分别浓缩至相对密度约1.05、1.10、1.15、1.20(60 ℃),将浓缩液定容至100 mL,混匀。按“2.2”项下浓缩液指标成分含量测定及“2.4”项下特征图谱的测定方法制备供试样品并进行检测。结果见表9与图7。
表9 不同浓缩密度结果 (n=4)
图7 不同浓缩密度样品特征图谱
由图7可知,不同浓缩密度样品特征图谱显示主要成分基本一致。表9结果表明,浓缩至不同密度对指标成分的含量影响较小。结合后续冻干工艺需求,本品药液浓缩至相对密度1.10~1.15(60 ℃)即可。
4.3 干燥方式考察
按优选工艺制备五味消毒饮的物质基准,平行煎煮3份,将药液合并后60~65 ℃缩并定容至150 mL,混匀,各取浓缩液50 mL,分别进行常压80 ℃干燥、减压70 ℃干燥和-45 ℃冷冻干燥考察。按“2.2”项下干燥粉指标成分含量测定及“2.4”项下特征图谱的测定方法制备供试样品并进行检测,考察不同干燥方式对指标成分及特征图谱的影响,并采用综合评分法进行优选,结果见表10与图8。
表10 不同干燥方式结果 (n=3)
图8 不同干燥方式特征图谱
由图8结果表明,不同干燥方式样品特征图谱显示主要成分基本一致。通过表10,综合评分结果表明冷冻干燥方式最优,且冷冻干燥能够有效防止热敏性成分被破坏,且物料色泽、气味等都能很好地保留,复水性好,在中药干燥中具有特有的优势。最终选择冷冻干燥工艺进行干燥[14]。
4.4 五味消毒饮物质基准的制备工艺
在遵循古籍原文的基础上,通过特征图谱、多指标成分含量及综合评分优选五味消毒饮的最佳煎煮工艺:取金银花11.19 g,野菊花4.48 g,蒲公英4.48 g,紫花地丁4.48 g,天葵子4.48 g等药材(麻豆大小),置1.8 L砂锅中,加水400 mL,用电陶炉作为热源,先武火加热至沸,后文火保持微沸煎至160 mL,加入黄酒100 mL,再滚二三沸时(沸腾后离火,不沸后再加热,每沸时约1 min,重复3次),以200目滤布滤过;药渣同法再煎煮1次。合并两次煎液,60~65 ℃下减压浓缩至相对密度为1.10~1.15(60 ℃),放冷,预冻至结冰,冷冻干燥,研细,混匀,即得。
5、多批次物质基准的制备及特征图谱的建立
按照优选的最佳制备工艺,采用随机数字法制备15批五味消毒饮物质基准。取15批冻干粉,按照“2.4”项下特征图谱的测定方法制备供试样品并进行检测,记录色谱图,统计特征峰的保留时间及相对保留时间(见表11和表12),用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)将图谱叠放(见图9)。图中S1~S15代表15批冻干粉,生成的对照特征图谱见图10。
供试品特征图谱中应有8个特征峰,其中7个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同,与绿原酸参照物峰相应的峰为S峰,计算特征峰1~8 的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10 %之内。规定值为:0.56(峰1)、1.00(峰S)、1.11(峰 3)、1.22(峰4)、3.45(峰 5)、3.72(峰 6)、4.34(峰 7)、5.85(峰 8)。
表11 五味消毒饮特征图谱保留时间
表12 五味消毒饮特征图谱相对保留时间
图9 五味消毒饮15批物质基准特征图谱
图10 对照特征图谱
6、讨论
6.1 加水量及剂量分析
五味消毒饮最早载于清代《医宗金鉴》,书中记载:“金银花三钱、蒲公英、菊花、紫花地丁、紫背天葵子各一钱二分,水二盅,煎八分、加无灰酒半钟,再滚二三沸时,热服。渣,如法再煎服。”通过对明清时期度量衡考证,明确明清时期度量衡与现代换算关系[15],一钱相当于今3.73 g, 一盅为200 mL。故确定五味消毒饮处方的计量为:金银花11.19 g、野菊花4.48 g、蒲公英4.48 g、紫花地丁4.48 g、天葵子4.48 g, 加水量为400 mL,煎煮终点为160 mL,酒100 mL。
6.2 无灰酒分析
古方中常用酒作药引或炮制的辅料。如果酒中有其他药物或杂质,会对药物产生影响,进而影响药效,因此对酒的运用也十分讲究,制药强调用无灰酒。《东医宝鉴》认为:“无灰酒不杂他物者,即醇酒也。”《说文》云:“厚曰淳,薄曰离。”无灰酒,其色黄,甘而温,和血良。书中硵砂煎丸治疗“一切积滞,化气消食。补益真气,产后逐败血,补虚损至善”[16]。经考证,清代经典名方“五味消毒饮”中所用“无灰酒”则应为以糯米为原料、用白曲所酿的糯米酒,与《中华人民共和国药典》2020年版所载黄酒一致[17]。
6.3 制备工艺分析
“遵古”是经典名方研究开发遵循的主要原则,本实验前期经过严格详细的考证,确定了五味消毒饮的剂量、加水量、炮制工艺等参数。并采用特征图谱及指标成分的含量分析方法与传统药锅煎煮相结合的方式优选最佳煎煮工艺,确定了药材的粉碎粒度、煎煮容器、加热方式、浓缩温度、干燥方式等关键工艺参数。
6.4 含量测定及特征图谱分析
根据2020版《中华人民共和国药典》,筛选五味消毒饮中金银花、蒲公英、野菊花的指标成分,初步确定为绿原酸、木犀草苷、秦皮乙素、蒙花苷。另通过查阅文献,蒲公英和野菊花中绿原酸的含量较高,并通过15批药材的分析检验,建立了野菊花、蒲公英的绿原酸的质量标准。通过对五味消毒饮中的绿原酸、蒙花苷、秦皮乙素、木犀草苷等成分进行含量测定,作为控制五味消毒饮物质基准制备过程中质量传递的控制方法。除此之外,本研究对15批五味消毒饮的物质基准进行特征图谱分析,标定了其中7个峰,分别是绿原酸、秦皮乙素、咖啡酸、异绿原酸B、原酸A、异绿原酸C、蒙花苷,这7个峰分别来源于不同药材,能够全方面反映五味消毒饮的质量信息。通过对五味消毒饮有效成分的质量控制结合特征图谱的方法制定五味消毒饮物质基准的质量标准,具有可行性、稳定性,能够较好地反映五味消毒饮冻干粉的物质群及质量,为五味消毒饮制剂研究奠定了基础。
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文章来源:孙志强,刘晓美,代龙等.基于多指标成分含量测定的五味消毒饮制备工艺及特征图谱研究[J].亚太传统医药,2024,20(01):30-38.
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2024-03-24西罗莫司是一种疗效强、毒性低的新型免疫抑制药物,在临床上主要用于防治肾移植物的排异反应,也是肝癌患者肝移植术后理想的免疫抑制药物[1,2]。但西罗莫司自身药动学的个体间差异较大,且对细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)有影响的药物均会对西罗莫司的肝-肠代谢等药动学行为造成影响[3],因此,西罗莫司与联用药物间的药物-药物相互作用(drug-drug interaction,DDI)就成为影响西罗莫司血药浓度的关键因
2024-03-21人群流行病学研究资料显示,砷暴露危害男性生殖系统,砷介导的氧化应激被认为是砷致雄性生殖毒性的主要发病机制之一[1]。砷诱导的氧化应激可引起线粒体功能障碍[2]。目前,砷的雄性生殖损伤尚缺乏有效的防治措施。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSPs)是一种天然抗氧化剂,在抗氧化、抗炎、调节线粒体功能等方面具有广泛的药理作用[3]。
2024-03-15植物源化合物对人体健康有着极大益处,其中植物多酚一直是研究者们关注的焦点。植物多酚是抗菌、抗癌等药理药物的主要来源,具有安全性高的优点,广泛存在于蔬菜、水果、谷物等食物中。由于其多酚结构的差异,具有不同的功能活性和生物利用度。
2024-02-28九味生化颗粒是酒钢医院根据临床需要而创新研发的纯中药制剂,前期已对其主要成分川芎、益母草、山楂、红花、桃仁、甘草进行了薄层色谱法鉴别,对其主要成分阿魏酸采用高效液相色谱(HPLC)法进行含量测定。
2024-02-22金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus是具代表性的G+机会性致病菌,在全球范围内形成严重的发病率和死亡率[1]。由于抗生素的过度或不合理使用,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的金黄色葡萄球菌耐药情况越趋严重。除了对抗生素使用进行更加科学、准确和对症的管理外,急需开发抗生素的替代品[2]。
2024-02-20人气:14207
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期刊名称:国际中医中药杂志
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主管单位:中华人民共和国国家卫生健康委员会
主办单位:中华医学会,中国中医科学院中医药信息研究所
出版地方:北京
专业分类:医学
国际刊号:1673-4246
国内刊号:11-5398/R
邮发代号:2-611
创刊时间:1978年
发行周期:月刊
期刊开本:16开
见刊时间:10-12个月
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