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植物药复方MYD-20抗金黄色葡萄球菌的作用及机制研究

2024-02-20 112 上传者：管理员

摘要：目的研究植物药复方MYD-20及其软膏剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用及初步作用机制。方法采用肉汤稀释法测定复方MYD-20对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Methicillin-resistant S.aureus(MRSA)临床菌株的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC);通过测定药物处理后菌液的碱性磷酸酶(AKP)活性、胞外大分子浓度变化以及扫描电子显微镜的观察结果确定复方MYD-20的抑菌作用机制；建立小鼠烫伤感染模型，探究MYD-20软膏剂的药效作用。结果 MYD-20对金黄色葡萄球菌和MRSA表现出强抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、MRSA的MIC和MBC均分别为1.0%、2.0%。经MYD-20处理后，菌液中AKP的活性、胞外大分子的含量均显著上升，结合扫描电子显微镜的观察结果，发现细菌的表面结构受到破坏。MYD-20软膏剂对皮肤深Ⅱ度烫伤感染的模型小鼠显示出显著的创口愈合作用；并降低了创口处炎症因子的表达。结论复方MYD-20对金黄色葡萄球菌和MRSA具有较强的抗菌作用，其作用机制与破坏细菌细胞膜、细胞壁的通透性和完整性，导致细胞内容物泄露有关。此外，MYD-20软膏剂能有效降低烫伤感染小鼠创口处的炎症水平，促进创口愈合。

关键词：
抑菌活性
最低抑菌浓度
最低杀菌浓度
梯度稀释法
植物药复方
深Ⅱ度烫伤感染
耐甲氧西林金黄色葡萄球
软膏剂
金黄色葡萄球菌
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金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus是具代表性的G+机会性致病菌，在全球范围内形成严重的发病率和死亡率[1]。由于抗生素的过度或不合理使用，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的金黄色葡萄球菌耐药情况越趋严重。除了对抗生素使用进行更加科学、准确和对症的管理外，急需开发抗生素的替代品[2]。近年来，以中草药为主的抑菌复方、中西药配伍制剂，因其不良反应相对较小、不易发生耐药等优势，日益受到重视[3]。课题组多年致力于抗菌植物类药材的筛选与研究工作，基于前期研究基础，现以金黄色葡萄球菌为研究对象，对实验室自主研发的以大黄Rheum palmatum L.、黄芩Scutellaria baicalensis Georgi、厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.等多种植物药组成的复方MYD-20,进行体外、体内抑菌作用及初步作用机制研究，以期为抗金黄色葡萄球菌及耐药金黄色葡萄球菌植物药的开发和利用提供参考。

1、实验部分

1.1 仪器、试药与动物

Spectra Max M2型酶标仪(美国Molecular Devices)。96T碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);药敏试验纸盘(比克曼生物科技有限公司);植物药复方MYD-20(自制);夫西地酸软膏(香港奥美制药)。金黄色葡萄球菌标准株(西南交通大学生命科学与工程学院微生物实验室，ATCC25923);耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床株(MRSA,四川省人民医院·四川省医学科学院);6周龄SPF级♂BALB/c小鼠(成都达硕实验动物有限公司，合格证：SCXK川2015-030),体重18～20 g。

1.2 方法与结果

1.2.1 复方MYD-20及其浸膏的制备

将植物药材分别粉碎、研磨至100目，分别称取50 g药材粉末，置棕色广口瓶中，加入200 mL 75%乙醇混合均匀，浸泡30 d。各药材按比例配成植物药复方MYD-20,醇提液用纱布过滤，收集上清液，置4 ℃下保存。取100 mL复方MYD-20,置圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，得到约10.8 g干浸膏，密封，置4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 复方MYD-20的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)的测定

采用肉汤稀释法，依次按1%、2%、3%的梯度分别稀释MYD-20,加入对数生长期的细菌(1.0×107 CFU·mL-1),使得终浓度为1×106 CFU·mL-1。于37 ℃、200 r·min-1振荡孵育6 h后，取100 μL涂布于平板上，倒置37 ℃恒温培养箱中培养24 h。以出现单菌落数最少的最高浓度为MYD-20的MIC,以无单菌落生长的最高浓度为其MBC。由图1可知：复方MYD-20对金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC、MBC无差异，均分别为1%、2%。

1.2.3 复方MYD-20对金黄色葡萄球菌细胞壁的影响

取对数生长期的金黄色葡萄球菌悬液(1.0×107 CFU·mL-1),加入MYD-20处理，最终药物浓度为0.5 MIC、1 MIC,加入等量无菌水作为对照组。将混合物于37 ℃、200 r·min-1振荡孵育2 h, 每隔30 min取样1次。孵育毕，以5×103 r·min-1离心10 min, 取上清液，按说明书使用碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒测定AKP的活性，以King’s unit·(100 mL)-1表达。每组实验重复3次。由图2可知：0.5 MIC、1 MIC浓度处理下，金黄色葡萄球菌菌液AKP的活性在2 h内均极显著增加(P<0.01),在2 h达到最大值66.4 King’s unit·(100 mL)-1。与0.5 MIC的MYD-20比较，1 MIC组AKP的活性增加更为显著(P<0.01)。经MYD-20处理后，菌液AKP的活性呈现出时间和浓度依赖性。

图1 MYD-20对金黄色葡萄球菌、MRSA的MIC和MBC

图2 MYD-20处理对金黄色葡萄球菌菌液AKP活性的影响

1.2.4 复方MYD-20对金黄色葡萄球菌细胞膜的影响

通过测定金黄色葡萄球菌向缓冲液中释放的核酸及可溶性蛋白质，确定MYD-20对细胞内大分子释放的影响[5]。取对数生长期的菌悬液(1.0×107 CFU·mL-1),收集菌体沉淀。使用DEPC处理过的PBS缓冲液(0.01 mol·L-1,pH7.2)清洗菌体沉淀2次，在等体积PBS缓冲液中进行重悬。加入MYD-20使浓度为0.5 MIC和1 MIC,对照组加入无菌水，恒温振荡孵育2 h, 每隔30 min取样1次。孵育后以5×103 r·min-1离心10 min, 取上清液，用酶标仪在260 nm处测定吸光度。同时用BCA试剂盒测定上清液中蛋白质的浓度。每组实验重复3次。由图3可知：与对照组比较，随着药物处理浓度和时间的增加，0.5 MIC和1 MIC浓度处理的菌悬液中OD260在2 h内均极显著升高(P<0.01),初步认为MYD-20处理后的菌液中，核酸的含量显著升高，并呈现时间和浓度依赖性。同时，MYD-20处理2 h后，上清液中可溶性蛋白的含量较对照组有极显著变化(P<0.01),0.5 MIC和1 MIC处理组蛋白的释放量最大分别提高了23.77、65.32倍。

图3 不同浓度MYD-20处理后金黄色葡萄球菌胞外大分子核酸(A)和可溶性蛋白(B)的浓度变化

1.2.5 复方MYD-20对金黄色葡萄球菌形态结构的影响

为阐明不同浓度的MYD-20对金黄色葡萄球菌形态的影响，参照文献方法，对处理后的细菌进行扫描电子显微镜(SEM)观察[6]。菌悬液分别用1 MIC和2 MIC的MYD-20处理，于37 ℃培养6 h, 离心收集菌体沉淀。用PBS缓冲液清洗菌体3次，用2.5%戊二醛固定，于4 ℃下过夜。送样制备切片并量电镜下观察。由图4可知：在SEM下，未经药物处理的金黄色葡萄球菌的菌体形态饱满圆润，表面光滑；经MYD-20处理后，菌体出现不同程度的损伤和形态变化，其中，1 MIC处理组细菌表面出现不规则的凹陷；而在2 MIC处理组中，大部分细胞呈黏连状态，菌体出现明显的凹陷和黏连。

1.2.6 MYD-20软膏对皮肤烫伤感染模型小鼠的创口修复和抗炎作用

为方便使用、控制给药剂量及更好地发挥抗菌作用，优化了复方软膏剂的制备条件为：取MYD-20浸膏0.74 g, 加入凡士林0.5 g、羊毛脂1.0 g、蜂蜡0.8 g、硬脂酸1.5 g、单硬脂酸甘油酯0.5 g, 在85 ℃水浴中加热至融化。另取甘油1.5 g、蒸馏水6.5 g、吐温80 1.8 g, 同等温度下水浴加热至融化。将两种液体混合，持续搅拌均匀，冷却至室温，即得MYD-20软膏，其中，MYD-20复方植物药的含量为5%。将40只小鼠随机均分为阳性(夫西地酸软膏)组、MYD-20软膏组、阴性组(软膏基质)、空白组(不作任何处理)。ip三溴乙醇溶液麻醉小鼠，将直径1.8 cm不锈钢圆棒置沸水浴中加热10 min, 取出后快速与小鼠的皮肤接触10 s, 造成小鼠深Ⅱ度烫伤。待小鼠皮肤冷却后，在3组小鼠背部烫伤面涂抹0.3 mL处于对数生长期的金黄色葡萄球菌菌悬液1.0×107 CFU·mL-1。阴性组、阳性组、MYD-20软膏组每天每只早晚各两次分别涂抹软膏基质、夫西地酸软膏、MYD-20软膏0.5 g, 空白组不做任何处理。持续21 d。每日观察记录小鼠的状态，拍照记录创口愈合情况，通过Image J软件计算创口面积。在第3天时，每组随机选取5只小鼠，麻醉后取小鼠创口处的皮肤组织，用通用型组织固定液中固定过夜。送样成都赛因斯特公司，采用免疫组化法测定组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)的含量。由图5可知：第21天时，阳性组和MYD-20软膏组所有小鼠的创面基本痊愈，创口处的皮肤基本长出毛发；阴性组小鼠尚有小面积创口未全部愈合。阳性组和MYD-20软膏组小鼠创口的愈合率均显著高于阴性组(P<0.01)。由图6可知：阳性组和MYD-20软膏组小鼠的创口组织中，TNF-α和IL-6的表达水平均显著低于阴性组(P<0.01)。

图4 对照组(A)、1 MIC处理组(B)、2 MIC 处理组(C)金黄色葡萄球菌的扫描电子显微镜图

1.2.7 统计学分析

数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。利用t检验分析差异的显著性。所有数据均以表示。P<0.05时认为数据具有统计学意义。

图5 MYD-20软膏对烫伤感染模型小鼠不同时间点的创口变化(A)和第21天的伤口愈合率(B)

图6 MYD-20软膏对小鼠创口皮肤促炎因子TNF-α和IL-6影响的免疫组化染色图(A,400×)和平均光密度分析(B)

2、讨论

大黄中的有效成分大黄酸能破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，导致菌体中大分子物质外渗，发挥抑菌作用；黄芩中的有效成分黄芩素可通过改变细胞膜通透性、影响菌体蛋白质的合成，来抑制菌体的生长和繁殖[7];厚朴中的和厚朴酚及其类似物具有抗菌等多种药理作用[8]。复方MYD-20主要由这3种植物药材配伍组成。文中结果显示：复方MYD-20对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床菌株的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度与金黄色葡萄球菌标准株相同。证实了MRSA对复方MYD-20的敏感度水平与金黄色葡萄球菌相同，表明复方MYD-20具有被开发为新型天然植物抗菌剂的潜力。碱性磷酸酶是一种细胞壁和细胞膜之间的细胞内酶，不能穿过完整的细胞壁，故胞外的碱性磷酸酶活性可以反映细胞壁的受损程度。核酸是遗传信息的载体，蛋白质提供结构和功能，其泄漏会导致细胞死亡[9]。通常通过检测胞外的核酸浓度及可溶性蛋白浓度的变化，来评价药物对微生物细胞膜通透性和完整性的影响。在以上实验的基础上，进一步通过扫描电镜观察药物对细菌形态结构的影响。结果表明：植物药复方MYD-20通过破坏金黄色葡萄球菌细胞膜、细胞壁的通透性和完整性，导致细胞内容物泄露，从而起到抑制和杀灭细菌的作用。在确认复方MYD-20对金黄色葡萄球菌的抑菌作用和初步机制的基础上，为方便给药和更好地控制给药剂量，将其从酊剂制备成软膏剂，并建立了小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤的金黄色葡萄球菌感染模型，研究MYD-20软膏对皮肤烫伤感染的药效作用。结果MYD-20软膏可有效提高烫伤感染创口的愈合速率，且能降低创口处的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6水平。这可能是由于MYD-20软膏中的有效成分具有抗菌作用，可抑制伤口处细菌的生长，同时软膏可为创口提供湿润和密闭的环境，综合作用降低了炎症反应。

参考文献:

[8]王隽,李栋,钟佳伶,等.抗金黄色葡萄球菌中药材的筛选及其复方MW1810抗菌机制的初探[J].华西药学杂志,2021,36(4):388-394.

基金资助:四川省科技厅科技计划重点项目(2022YFS0437);

文章来源:戴晓婷,陈思,周代红等.植物药复方MYD-20抗金黄色葡萄球菌的作用及机制研究[J].华西药学杂志,2024,39(01):43-47.