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60Co辐射灭菌对紫草油质量的影响

2024-02-18 15 上传者：管理员

摘要：目的:考察三批次不同剂量60Co辐射灭菌对院内制剂紫草油的性状、定性鉴别、含量测定、微生物限度检查等质量控制指标的影响，为紫草油实现最终灭菌提供参考。方法:根据2020版《中华人民共和国药典》、四川省药品监督管理局批准的质量标准SZBZ20081112要求，观察紫草油性状变化；采用薄层色谱法对紫草油与紫草对照药材进行定性鉴别；采用紫外分光光度法，检测羟基萘醌总色素含量，在520 nm波长处测定吸光度，按左旋紫草素(C6H16O5)的吸收系数(E1%1 cm)为242计；采用微生物计数法，进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)等微生物限度检测。结果:3 kgy、5 kgy、6 kgy辐射灭菌后的制剂均符合质量标准的要求，10 kgy、20 kgy辐射灭菌后的制剂不符合质量标准的要求。结论:60Co辐射灭菌，具有灭菌作用显著、穿透力强、不需升高温度、无化学残留物、可实现带包装最终灭菌、操作简便等特点，能达到灭菌的效果，不影响紫草油质量，有实用价值。

关键词：
60Co辐射灭菌
含量测定
微生物限度检查
灭菌
紫草油
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紫草油为江油市中医医院自制院内制剂，由紫草、菜籽油等组成，具有凉血活血、解毒透疹的功效，用于血热毒盛所致斑疹紫黑、麻疹不透、疮疹、湿疹、水火烫伤、宫禁糜烂等。其临床使用30余年，成分安全、疗效确切，深受患者喜爱。但由于医院制剂生产条件所限，容易出现微生物限度不符质量标准要求的情况[1],灭菌既是制剂工艺中的重要环节，也是重大难点。本研究通过考察5个剂量辐射灭菌对紫草油质量控制指标的影响，为紫草油生产实现最终灭菌提供参考依据。

1、材料与方法

1.1 材料

生化培养箱SHP-160、蒸汽灭菌器YX-280B、洁净工作台YX-280B、电子分析天平FA2004B、紫外分光光度计UV2450、60Co辐射装置由中金辐照成都有限公司提供；胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、聚山梨酯80、甘露醇氯化钠琼脂培养基、紫草油(批号：221201、230201、230401)、紫草对照药材来自中国食品药品检定研究院，化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

3批次自制紫草油经3 kgy、5 kgy、6 kgy、10 kgy、20 kgy 5个剂量辐射灭菌后，根据2020版《中华人民共和国药典》[2]及紫草油质量标准SZBZ20081112进行性状、定性鉴别、含量测定、微生物限度检查等质量控制指标检测[3,4,5]。

2、结果

2.1 性状

3批次紫草油经3 kgy、5 kgy、6 kgy辐射灭菌后，性状无明显变化，颜色均为紫红色油状液体，气香。10 kgy辐射灭菌后紫红色轻微变浅，20 kgy辐射灭菌后紫红显著变浅。

2.2 薄层鉴别

供试品溶液制备：取本品5 mL,用乙醇振摇提取3次，每次10 mL,合并乙醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解。

对照药材溶液制备：取紫草对照药材0.5 g, 加石油醚(60～90 ℃)20 mL,超声处理20 min, 滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解。

照《中华人民共和国药典》2020年版四部薄层色谱法(通则0502),吸取上述二种溶液各4 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.5∶0.1)为展开剂展开，取出，晾干。在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显紫红色斑点；再喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，斑点变为蓝色。

3批次紫草油的薄层鉴别均显示，3 kgy、5 kgy、6 kgy辐射灭菌后的薄层定性鉴别与对照药材色谱一致，10 kgy辐射灭菌后定性鉴别颜色轻微变浅，20 kgy辐射灭菌后薄层定性鉴别颜色明显变浅，如图1所示(图中编号1、2、3、4、5、6分别代表未辐射灭菌、3 kgy、5 kgy、6 kgy、10 kgy、20 kgy辐射灭菌后紫草油的薄层图谱)。

2.3 羟基萘醌总色素含量测定

精密量取本品1 mL,置100 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，照《中华人民共和国药典》2020版紫外可见分光光度法(通则0401),在520 nm波长处测定吸光度，按左旋紫草素(C6H16O5)的吸收系数(E1%1 cm)为242计算，即得。本品每1 mL含羟基萘醌总色素以左旋紫草素(C6H16O5)计，不得少于0.6 mg。含量测定的系统适应性实验已验证符合含量测定要求，故本研究中不再进行相关验证。

羟基萘醌总色素含量测定显示，3 kgy、5 kgy、6 kgy辐射灭菌后羟基萘醌总色素含量无显著差异，符合质量标准要求。10 kgy辐射灭菌后羟基萘醌总色素含量稍有降低，仍符合质量标准要求，20 kgy辐射灭菌后萘醌总色素含量大幅下降，不符合质量标准要求。见表1。

表1 辐射灭菌前后羟基萘醌总色素含量

2.4 微生物限度检查

紫草油已按照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则微生物限度检查法(1105、1106)项下方法进行检查方法适用性进行验证，符合微生物限度检查的要求，故本研究中不再进行微生物限度检查方法适用性验证。采用2020年版《中华人民共和国药典》四部通则1105、1107非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，对紫草油进行微生物限度检查。紫草油微生物限度检查的标准为需氧菌总数不超过102cfu/mL,霉菌和酵母菌总数不超过102cfu/mL,控制菌不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。

2.4.1 需氧菌总数检查

供试液制备：取紫草油10 mL(分别从两个最小包装中各取5 mL),加最少量聚山梨酯80使溶解，加入胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 mL,制成1∶10(V/V)供试液，再用胰酪大豆胨液体培养基稀释成1∶100(V/V)、1∶1 000(V/V)供试液，共计3个稀释级。

供试液需氧菌总数检查：取3个稀释级的供试液各1 mL(每个稀释级平行做两个),加入胰酪大豆胨琼脂培养基，于30～35 ℃生化培养箱培养72 h, 逐日计数。

阴性对照需氧菌总数检查：取胰酪大豆胨液体培养基1 mL(平行做两个),加入胰酪大豆胨琼脂培养基，于30～35 ℃生化培养箱培养72 h, 逐日计数。

空白对照需氧菌总数检查：取胰酪大豆胨琼脂培养基(平行做两个),于30～35 ℃生化培养箱培养72 h, 逐日计数。

辐射灭菌前后紫草油需氧菌总数检查显示，3 kgy、5 kgy、6 kgy、10 kgy、20 kgy辐射灭菌后需氧菌总数均符合质量标准要求，结果见表2。

表2 辐射灭菌前后需氧菌总数微生物限度检查

2.4.2 霉菌和酵母菌总数检查

供试液霉菌和酵母菌总数检查：取“2.4.1”项中3个稀释级的供试液各1 mL(每个稀释级平行做两个),加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，于20～25 ℃生化培养箱培养120 h, 逐日计数。

阴性对照霉菌和酵母菌总数检查：取胰酪大豆胨液体培养基1 mL(平行做两个),加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25 ℃生化培养箱培养120 h, 逐日计数。

空白对照霉菌和酵母菌总数检查：取沙氏葡萄糖琼脂培养基(平行做两个),于20～25 ℃生化培养箱培养120 h, 逐日计数。

辐射灭菌后紫草油霉菌和酵母菌总数检查显示，3 kgy、5 kgy、6 kgy、10 kgy、20 kgy辐射灭菌后霉菌和酵母菌总数均符合质量标准要求，结果见表3。

表3 辐射灭菌前后霉菌和酵母菌总数微生物限度检查

2.4.3 控制菌检查(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)

供试液控制菌检查：取“2.4.1”项中1∶100(V/V)稀释级的供试液，30～35 ℃培养18～24 h, 取培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35 ℃培养18～72 h。

阴性对照供试液检查：取胰酪大豆胨液体培养基，30～35 ℃培养18～24 h, 取培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35 ℃培养18～72 h。

结果判定：若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上无菌落生长，判供试品未检出金黄色葡萄球菌，若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上无菌落生长，判供试品未检出铜绿假单胞菌。阴性对照品同理即得。

辐射灭菌后紫草油金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查显示，3 kgy、5 kgy、6 kgy、10 kgy、20 kgy金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查均符合质量标准要求。结果见表4、表5。

表4 辐射灭菌前后金黄色葡萄球菌检查

表5 辐射灭菌前后铜绿假单胞菌检查

3、讨论

本研究考察了5个辐射灭菌剂量对3批次紫草油质量控制指标的影响,结果显示,3kgy、5kgy、6kgy3个剂量辐射灭菌对紫草油的质量控制指标无影响,且符合质量标准相关要求,10kgy、20kgy两个剂量辐射灭菌对质量控制指标产生一定程度的影响,不建议使用,实验结果可为紫草油生产工艺实现最终灭菌提供参考依据。因此,在实际生产中,需加强对辐射灭菌剂量的研究,不得随意变更或新增辐照灭菌工艺和加大辐照剂量,以免影响制剂质量。

灭菌作为制剂生产的重要过程,相对于干热灭菌、湿热灭菌,辐射灭菌可带包装灭菌,实现最终灭菌,本研究中5个剂量辐射灭菌后,包材未发现任何变化。

辐射灭菌广泛应用于食品、药品行业,但缺乏相关法规约束,亟待加强。目前仅有两个相关要求规范:一是,2000年版《中华人民共和国药典》附录“灭菌法”收录了辐射灭菌法,并规定了常用辐射灭菌吸收剂量为25KGy,但应尽量采用低辐射剂量。二是,国家卫生部1997年发布《60Co辐照中药杀菌剂量标准》(内部试行)的通知(卫药发[1997]第38号),其中规定:凡“通知”中未规定的中药,原则上不允许辐照,若要辐照,则需向国家卫生部药品检验所报批,但系试行性质的内部通知,目前也仅供参考[6,7]。

参考文献:

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[7]白洁,迟玉明,金红宇,等.《中药辐照灭菌技术指导原则》解读[J].中成药,2017,39(7):1537-1538.

文章来源:赵雪梅,钟密.60Co辐射灭菌对紫草油质量的影响[J].亚太传统医药,2024,20(02):47-50.