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分析男男性行为人群HPV持续感染者外周血T淋巴细胞及血浆IL-2、IL-4水平

2020-06-24 427 上传者：管理员

摘要：目的分析男男性行为人群(MSM)人乳头瘤病毒(HPV)持续感染时外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、Treg淋巴细胞及血浆IL-2和IL-4细胞因子水平。方法在前期“男男性行为人群乙型肝炎病毒感染对人乳头瘤病毒持续感染的影响”动态队列中招募HIV阴性MSM，采集研究对象肛周脱落细胞及静脉血，收集其社会人口学及性行为相关特征。结果共纳入120例HIV阴性MSM受试者，外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、Treg淋巴细胞及血浆IL-2和IL-4细胞因子水平在HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定组间及低危、高危及混合型HPV感染组间差异均无统计学意义(P>0.05);HPV感染率为54.17%，持续感染率为20.00%;主要性行为特征自我认知为同性恋、发生肛交使用安全套、商业性行为及毒品使用在HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定三组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论研究未发现MSM人群HPV持续感染时外周血T淋巴细胞及血浆细胞因子水平改变;自我认知为同性恋、发生肛交使用安全套、商业性行为及毒品使用是MSMHPV持续感染的危险因素。

关键词：
IL-2
IL-4
人乳头瘤病毒
外周血T淋巴细胞
持续感染
男男性行为人群
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人乳头瘤病毒感染造成全球重大的卫生负担,主要因HPV相关癌症引起,其感染主要引发肛门癌、宫颈癌、口咽癌等[1,2]。尽管HPV感染是一种具有高清除率的一过性感染,但HPV高危型别的持续存在被认为是宫颈癌与肛门癌发生的关键因素[3,4]。由于无保护性性行为及生活方式的改变,中国的HPV感染率呈逐年递增趋势[5]。男男性性行为者,因其特殊的性行为方式,HPV感染率显著高于异性恋男性[6,7],HPV相关癌症的总发病率约为35/10万。

绝大多数HPV感染者会在4～20个月内清除体内的HPV病毒,但受一系列病毒免疫逃避机制的影响,10%的感染者体内将会有病毒持续存在而处于持续感染状态,并可能导致癌前损伤及癌变。目前对于病毒持续感染机制尚不明确,但越来越多的证据表明,体液和细胞免疫在HPV感染的自然史中发挥着重要的作用,而HPV感染的细胞清除主要依赖于适应性T细胞免疫[8]。长期HPV感染的宿主CD4+T细胞计数减少,Treg细胞异常存在,细胞免疫力下降及免疫缺陷导致HPV感染无法清除[9]。此外HPV感染能够下调促炎细胞因子并使细胞因子的产生向免疫抑制Th2表型倾斜[10]。因此本研究从免疫方面探讨MSM人群HPV持续感染时外周血T淋巴细胞及血浆细胞因子的水平,对该人群今后预防HPV持续感染及免疫治疗提供一定的科学依据。

1、对象与方法

1.1对象

通过乌鲁木齐市两所MSM非政府组织(non-governmentalorganizations,NGO)进行前期网络、现场宣传,在“男男性行为人群乙型肝炎病毒感染对人乳头瘤病毒持续感染的影响”动态队列中(该队列于2016年开始),于2019年1月1日-1月30日纳入MSM志愿者151例,排除HIV阴性者2例、采样不合格3例、新入组15例及随访时间不到一年11例(无法判断持续感染状态者)后,最终纳入HIV阴性MSM120例。

1.2方法

在“男男性行为人群乙型肝炎病毒感染对人乳头瘤病毒持续感染的影响”动态队列中,招募HIV阴性MSM志愿者,以填写问卷方式收集社会人口学及性行为特征等信息。主要内容包括:一般人口学特征(年龄、文化程度、婚姻状况、经济收入等)、性行为特征及相关因素[乙肝疫苗接种史、吸毒史(包括K粉、冰毒、摇头丸、“0”号胶囊、rush)、性病史及包皮环切术史等]。

采集肛周脱落细胞及血样进行实验室检测。肛周脱落细胞采集:经统一培训的志愿者使用生理盐水湿润的棉拭子,于研究对象肛管内3～5cm处采集脱落细胞,采样时于肛管处360°旋转并轻压肛管壁旋转1min,样本采集完成贴好研究对象唯一识别编号后置于4℃冰箱;之后将棉拭子浸泡于细胞保存液中,-20℃保存待检。静脉血采集:于EDTA抗凝管采集静脉血5mL,1500r/min,离心5min,分离上清至1.5mL离心管,-80°C保存用于IL-2及IL-4检测。剩余外周血立即进行CD4+T、CD8+T、Treg流式细胞术检测。

1.2.1HPV基因型分型检测

采用导流杂交法对37种基因型进行检测,主要包括:HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、71、72、73、81、82、83、84型;参考Huachun等[11]的研究,低危型包括HPV6、11、40、42、54、55、61、62、64、71、72、81、83、84型;高危型包括:HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、67、68、69、70、73、82型,混合感染:同时出现高危和低危型别中任意一种型别。

1.2.2流式细胞术

(1)CD4+T、CD8+T细胞检测:于流式管中加入PE-CyTM5MouseAnti-HumanCD3(2.5μL)、PE-CyTM7MouseAnti-HumanCD45(2.5μL)、FITCMouseAnti-HumanCD4(10μL)、PEMouseAnti-HumanCD8抗体(10μL);每支试管中加入全血样品60μL后于涡旋仪上震荡混匀;避光孵育15min;加红细胞裂解液2～3mL后混匀至溶液清澈透亮,1500r/min,离心5min弃上清,2mLPBS洗涤细胞,上机检测即可;(2)Treg细胞检测:于流式管中加入PE-CyTM7MouseAnti-HumanCD4(2.5μL)、BB515MouseAnti-HumanCD25(2.5μL)、PEMouseAnti-HumanCD127(2.5μL);每支试管中加入全血样品60μL后于涡旋仪上震荡混匀;避光孵育15min;加红细胞裂解液2～3mL后混匀至溶液清澈透亮,1500r/min,离心5min,弃上清,2mLPBS洗涤细胞,上机(Beckman-DXFLEX)检测即可。

1.2.3Elisa检测

血浆IL-2及IL-4检测用Elisa酶联免疫吸附法,单位为pg/mL,试剂盒购自武汉华美,严格按照试剂说明书操作,于450nm处在Thermo酶标仪(美国)上测量OD值并读数。

1.3HPV感染状态定义

HPV感染:本次检测中任意型别呈阳性;HPV持续阴性:在检测12个月当中,HPV任意型别基因型未检测出;HPV持续感染:任意型别感染持续时间≥12个月。HPV持续感染状态根据基线(2019年1月期间)时感染状态并结合2018年前两次随访时感染状态判定。

1.4统计学分析

采用Epidata3.1软件建立数据库并录入数据,用SPSS21.0软件对数据进行统计推断,计数资料采用χ2检验,计量资料满足方差正态性,用方差分析,不满足用非参数检验;多因素分析采用多分类Logistic回归,检验水准为α=0.05。

2、结果

2.1MSM基本人口学特征

此次共纳入符合标准的研究对象120例,平均年龄(35.53±7.94)岁(19～53岁);文化程度以本科及以上者居多;20例感染乙肝,4例乙肝感染状态未知;研究对象年龄、文化程度、婚姻状况及吸烟饮酒等人口学基本特征及是否感染乙肝在HPV阴性与阳性组间差异无统计学意义(P>0.05);65例感染HPV,HPV感染率为54.17%。

2.2不同性行为特征下MSMHPV感染情况

研究对象年龄、文化程度、婚姻状况及吸烟饮酒等人口学基本特征在三组间差异无统计学意义(P>0.05);24例持续感染HPV,HPV持续感染率为20.00%;自我认知为同性恋、发生肛交使用安全套、商业性行为及毒品使用三组间差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.3外周血T淋巴细胞及血浆IL-2/IL-4水平

对持续感染、持续阴性及持续感染状态未定三组间外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、Treg细胞与血浆IL-2及IL-4水平比较,结果见表2。

2.4不同HPV感染类型下MSM外周血T淋巴细胞及血浆IL-2、IL-4水平

对MSM不同HPV感染类型低危、高危与混合感染、HPV阴性时外周血CD3+T、CD4+T、CD8+T、Treg细胞及IL-2、IL-4水平比较,结果见表3。

3、讨论

据报道高危型HPV感染是引起肛门癌及口腔亚型癌症的主要原因,80%的肛门癌是因HPV感染引起的[12,13]。MSM人群发生癌症的可能性是异性恋男性的17倍[7],因其作为HIV感染的高危人群,近年来在性传播疾病如梅毒、淋病、HPV方面等也备受关注[14]。本研究中MSMHPV感染率为54.17%,介于泰国和秘鲁HIV阴性的MSM的58.00%和51.00%之间[15];持续感染率为20.00%,低于Nyitray等[16]的对MSM研究的持续感染率36.70%。对MSM主要性行为特征的单因素分析后发现,自我认知为同性恋、发生肛交使用安全套、商业性行为及毒品使用在HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定三组中差异有统计学意义(P<0.05),可能与MSM人群HPV感染率高于异性恋男性有关。本次研究对象发生肛交使用安全套比例较高,但HPV持续感染组持续感染率高于持续阴性组,提示该人群可能存在风险补偿,在采取保护措施的同时增加性伴或者性行为次数。三组间均存在一定比例商业性行为,与殷方兰等[17]研究结果一致;毒品使用比例以持续感染组较高,提示对于持续感染及持续感染状态未定人群,需加强对该部分人群健康教育从而减少高危性行为的发生。既往Giuliano[18]与黄冰雪等[19]研究表明,性行为中性伴数量、性行为方式等是MSMHPV感染的影响因素,尤其肛交性伴数量是HPV持续感染的影响因素,本研究中未发现肛交性伴数量在三组间有差异。

表1不同性行为特征下MSMHPV感染情况例(%)

人体免疫系统诱导的免疫反应对HPV感染转归至关重要,HPV感染引起的免疫反应是基于特异性CD4+T辅助细胞(Th)和CD8+T细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的适应性细胞免疫介导[20]。研究表明CD4+、CD8+细胞毒性T淋巴细胞以及高CD4/CD8比值有利于HPV转归,而少量的CD4+T、大量的CD8+T及Treg细胞与HPV持续感染发生有关[1]。宿主对HPV感染能产生特异性免疫应答,但并不能有效清除感染,病毒本身也会干扰机体正常的免疫应答反应使病毒发生免疫逃避,表现为HPV感染部位Treg细胞比例明显升高。Treg细胞作为一种免疫抑制细胞,通过抑制IL-2在CD4+T及CD8+T细胞中的表达而抑制T细胞的活化[21]。本次研究中,CD4+T、CD8+T、Treg细胞在HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定三组间差异无统计学意义(P>0.05),考虑可能与HPV感染引起局部免疫反应有关,且本次研究对象均为男性,男性对免疫应答的反应弱于女性[22]。一项基于人类与啮齿动物的研究表明,固有免疫细胞(单核、巨噬及树突壮细胞)的数量及活性,以及炎症性免疫反应,女性高于男性[23]。

表2HPV持续阴性、感染状态未定与持续感染三组间MSM外周血T淋巴细胞及血浆IL-2、IL-4水平

表3不同HPV感染类型下MSM外周血T淋巴细胞及血浆IL-2、IL-4水平

CD4+T细胞通过CD40-CD40配体诱导抗原递呈树突状细胞活化,或直接通过调节CD8+T细胞释放细胞因子(IL-2),可刺激分化为效应T细胞(Th1、Th2、Th17)以及Treg细胞。Th1主要产生IFN-γ及IL-2参与适应性免疫,Th2主要产生IL-4、IL-10及IL-6参与固有免疫[24]。研究报道外周血单核细胞上皮内瘤变及宫颈癌患者与对照组相比,在有丝分裂源刺激下,IFN-γ及IL-2水平下降而IL-4水平升高;同时,Scott等[25]研究表明IFN-γ表达与IL-4表达缺失是HPV感染清除的必要条件,若未能维持这种模式可能与HPV持续感染有关。本研究在开始推测HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定组在IL-2及IL-4水平上有所差异,但最终分析结果表明IL-2及IL-4水平在各组间差异无统计学意义。综合CD4+T、CD8+T及Treg细胞考虑,出现此结果原因可能有:(1)HPV感染后,体液免疫不能总是被观察到,约40%～60%的女性和较低比例的男性产生特异性的抗体[26];(2)大多数HPV感染高度局限于鳞状上皮细胞,局部免疫的改变可能未引起全身特异性免疫的发生[27];(3)推测可能与HPV感染者体内T细胞活性及数量较低而对抗原免疫较弱有关,一项关于小鼠模型的研究表明,初始病毒剂量与潜在反应性T细胞数量的关系对于诱导新生小鼠Th1和Th2反应以及保护性免疫的发展至关重要[28]。

研究局限性包括:(1)因该人群特殊性及免疫指标测量的即时性,研究样本量小,持续感染未按照高危型型别具体分型;(2)研究对象的性行为特征是自我报告的,存在信息偏倚。本次研究虽暂未发现MSM的CD4+T、CD8+T、Treg细胞及血浆IL-2、IL-4水平在HPV持续感染、持续阴性及持续感染状态未定组间的差异,但对于持续感染以及持续感染状态未定者应重点关注,坚持对其随访,观察其1年后HPV转归结局以及免疫水平,为建立MSM人群HPV持续感染的免疫预测标志物提供一定的科学依据。

参考文献：

[17]殷方兰,钟培松,张永杰,等.不同性取向的男男性行为人群行为特征差异性分析[J].中国皮肤性病学杂志,2018,32(8):898-901.

[19]黄冰雪,阿比旦·艾尼瓦尔,田恬,等.不同性角色男男性行为人群的肛周人乳头瘤病毒感染及影响因素分析[J].中华疾病控制杂志,2017,21(12):1236-1240.

陈珍,古丽斯亚·海力力,罗涛,迪力拜尔·阿里木,戴江红.男男性行为人群HPV持续感染者外周血T淋巴细胞及血浆IL-2､IL-4水平分析[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(02):173-178.

基金:国家自然科学基金项目(81560539).