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5例HIV-1感染者pol基因进化和感染时间推断研究

2021-06-08 1270 上传者：管理员

摘要：目的研究未接受抗反转录病毒治疗的HIV-1感染者pol基因进化特征,并用贝叶斯合并理论推断感染时间,为艾滋病疫情评估提供依据。方法募集5例未接受抗反转录病毒治疗的HIV-1感染者,定期随访并采集血样,用RT-PCR法扩增pol基因片段,分析基因型耐药突变;采用贝叶斯合并理论分析毒株进化关系,构建最大可信（MCC）进化树,推测其最近共同祖先株形成时间,进而推断感染时间。结果5例HIV-1感染者均为男性,年龄为27～50岁。每例感染者有5～9个采样时间点,其pol基因序列各自聚集成一个独立的次级进化簇（后验概率值为100%）。1例急性期感染者携带传播性耐药突变（M46I突变）,并表现出快速疾病进展和准种病毒变异特征。推断3例急性期感染者的感染时间为HIV抗体初筛有反应前1～5个月;2例初检即确证病例感染时间分别为HIV抗体初筛有反应前14个月和前7个月。结论运用贝叶斯合并理论分析HIV-1感染者pol基因进化情况,可大致推断感染时间,有助于艾滋病疫情形势研判。

关键词：
基因进化
感染时间
艾滋病
艾滋病病毒
贝叶斯合并理论
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一些HIV感染者早期无症状或症状不典型，传播具有隐匿性[1]。2018年我国新报告艾滋病病毒感染者和艾滋病患者（HIV/AIDS)14.8万例，估计当年新发感染8.1万例[1,2]，其中约45.5%的新报告HIV/AIDS病例为既往感染病例[1]。准确判定新发现HIV/AIDS病例的感染时间，对了解艾滋病流行趋势、制订和实施艾滋病防控策略具有重要意义[3]。目前推断HIV感染时间常用的方法是BED捕获酶联免疫法和HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫法，但这两种方法只能用于估计群体新发感染水平，不能用于个体诊断，且易受到抗病毒治疗、机体免疫水平和检测样本保存质量等因素影响，限制了在临床诊疗研究中的应用[4,5,6,7]。

HIV-1遗传多样性随时间的推移呈线性增加[8]。贝叶斯合并理论结合分子钟模型可用于推断HIV-1起源时间和传播事件起始时间[9,10,11]。本研究对筛查发现的HIV-1感染者进行随访，检测不同采样时间的pol基因片段并分析基因进化特征，采用贝叶斯合并理论推断其感染时间。现报道如下。

1、对象与方法

1.1对象

选择北京市疾病预防控制中心HIV抗体初筛发现且未接受抗反转录病毒治疗（antiretroviraltherapy,ART）的5例HIV-1感染者为研究对象。本研究遵循知情同意原则，通过北京市疾病预防控制中心伦理委员会审查。

1.2方法

1.2.1HIV抗体检测

HIV抗体筛查试验采用雅培化学发光、生物梅里埃、北京万泰HIV抗原抗体检测试剂；确证试验采用上海英旻泰公司HIV-1/2抗体检测试剂。

1.2.2随访

HIV抗体检测结果不确定病例每2～4周随访1次，随访至HIV感染确证。确证后每年随访1～2次，采集静脉血样，采用贝克曼公司FC500流式细胞仪检测CD4+T淋巴细胞（CD4细胞），采用RT-PCR法检测HIV-1基因型耐药。接受ART治疗后停止随访。随访样本编号方式为病例编号加01、02……

1.2.3HIV-1核酸提取

采用Roche公司MagNaPureLC2.0核酸提取仪从200µL血浆样本中提取病毒RNA，用TakaraBio公司OneStepRNAPCRKit(AMV）试剂，RT-PCR法扩增HIV-1pol基因片段，扩增引物（外套引物对：MAW26和RT21；内套引物对：PRO-1和RT20）和扩增条件参见文献[12]。

1.2.4系统进化分析和亚型判定

阳性扩增子送北京诺赛基因组研究中心有限公司采用Sanger法测序。获得的Abi序列文件采用Sequencher5.0软件进行序列拼接和清理，然后用LosAlamos国家实验室HIVDatabase在线工具GeneCutter进行基于密码子的序列比对。采用Mega6.0软件，参数设置为自展法（bootstrap）检验、最大构成似然法（maximumcompositelikelihood）模型，通过1000次重复运算构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统进化树，进行亚型鉴定和聚类分析。

1.2.5HIV-1基因型耐药分析

将获得的pol基因序列通过美国斯坦福大学HIV耐药数据库HIVdb程序和CPR工具（https://hivdb.stanford.edu）进行基因型耐药突变判读和耐药程度解析，预测传播性耐药[12]。

1.2.6贝叶斯合并理论分析

采用BEAST1.10软件处理比对后的pol基因片段序列，赋值样本采集时间，设置GTR+Gamma+InvariantSites、松弛型分子钟、Bayesianskylineplot模块，用马尔科夫链蒙特卡洛方法（MarkovchainMonteCarlo,MCMC）运行2×108次计算，计算每例随访感染者的最近共同祖先株形成时间（timetothemostrecentcommonances-tor,tMRCA）、95%较高后验密度区间（higherposte-riordensityinterval,HPD）及pol基因进化速率，根据tMRCA值计算感染时间。舍弃10%的MCMC运算结果，采用TreeAnnotator1.10.2软件解析并构建最大可信（maximumcladecredibility,MCC）进化树，并用Figtree1.4软件解读，后验概率值>90%为可靠的进化簇[10,13]。

2、结果

2.15例HIV-1感染者随访及筛查情况

5例HIV-1感染者均为男性，年龄为27～50岁。除XF027和XF151外，其他3例为北京市以外户籍。其中4例经男男性行为（menwhohavesexwithmen,MSM）感染，1例经异性性行为感染（XF027）。3例HIV抗体初筛有反应、HIV抗体不确定，且随访检测呈现进展性免疫印迹（westernblot,WB）带型，为Fiebig急性期Ⅳ期；2例初次检测即确证HIV抗体阳性，且此前6个月内未接受过HIV抗体筛查。采样时间跨度为7个月至4.5年，每例感染者有5～9个采样时间点。感染者BL1596、XF151和BL2290随访超过4年，前2例的CD4细胞计数维持在500个/µL以上。见表1。

感染者XF027于2010年2月15日HIV抗体初筛有反应、HIV抗体不确定，WB带型为p24/gp120/gp160,16天后随访检测WB带型为p17/p24/p31/gp41/p51/p66/gp120/gp160（全条带）。确证后首次CD4细胞计数为452个/µL。

感染者XF053于2010年2月25日MSM人群随访检测HIV抗体初筛阴性。5月10日随访检测HIV抗体初筛有反应、WB带型为p17/p24/gp160，报告为HIV抗体不确定。15天后随访WB带型为p17/p24,6月8日WB带型转为全条带。确证后首次CD4细胞计数为68个/µL,1周后达到227个/µL,1个月后降至169个/µL,2个月后维持在300个/µL左右。

感染者XF151于2011年4月7日HIV抗体初筛有反应、WB带型为p24/gp120/gp160，报告为HIV抗体不确定；2个月后随访检测WB带型为全条带。确证后首次CD4细胞计数为1116个/µL。

2.25例HIV-1感染者感染时间推断

5例感染者pol基因片段构建的MCC进化树见图1。感染者不同采样时间点获得的序列各自形成一个独立的次级进化簇，后验概率值为100%。感染者BL1596、BL2290与CRF07＿BC参考株（GenBank收录号KF250366）一起形成大单系进化簇。感染者XF053与B'亚型毒株（GenBank收录号HQ215554）聚集成大单系进化簇，后验概率值为100%。感染者XF027和XF151分别与g5(GenBank收录号JX112798）和g4CRF01＿AE(GenBank收录号JX112796）参考株[9]聚集成大单系进化簇，后验概率值均为100%。贝叶斯合并理论分析5个病例体内pol基因进化速率为1.67×10-3替换/核苷酸/年。

推测感染者XF027的感染时间为2009年11月，距2010年2月HIV抗体初筛有反应2～3个月；XF053的感染时间为2009年12月，距2010年5月HIV抗体初筛有反应4～5个月；XF151的感染时间为2011年2月，距2011年4月HIV抗体初筛有反应1～2个月。BL1596的感染时间为2013年9月，距2014年12月HIV抗体初筛有反应14～15个月。BL2290的感染时间为2015年7月，距2016年3月HIV抗体初筛有反应7～8个月。见表1。

图15例感染者HIV-1pol基因MCC进化树

表15例HIV-1感染者信息及贝叶斯合并理论分析结果

2.35例HIV-1感染者基因型耐药情况

XF151、BL1596和BL2290未发现耐药突变。XF027各采样时间点获得的pol基因片段均携带V179E突变，对依非韦伦和奈韦拉平潜在耐药。XF053表现出耐药相关突变的动态变化：XF053-01(2010年5月18日采集）血样携带M46I突变，对奈非那韦中度耐受，携带E138G/V179E突变，对依非韦伦和奈韦拉平低度耐药；XF053-02(2010年5月25日采集）、XF053-04(2010年6月12日采集）、XF053-05(2010年6月17日采集）、XF053-06(2010年7月20日采集）血样仅检测到V179E突变；XF053-07(2010年8月30日采集）血样新增T215I突变，对齐多夫定低度耐药，3个月后，XF053-10(2010年11月26日采集）血样仅保留V179E突变。XF053携带传播性耐药突变，且表现出准种病毒变异的变化特征：XF053-01血样的M46I突变和XF053-07血样的T215I突变，后续随访采样检测这2个突变位点均消失。

3、讨论

本研究提供了推断HIV感染时间的一种方法，即获得感染者随访pol基因序列，运用贝叶斯合并理论分析基因进化特征[3,14]，推算感染毒株最近共同祖先株形成时间，推断感染时间。本研究纳入的5例HIV-1感染者中，XF027、XF053和XF151确证前1～2个月HIV抗体初筛有反应，并呈现进展性WB带型，处于Fiebig急性期Ⅳ期[15]，推断分别在HIV抗体初筛有反应前2～3个月、4～5个月和1～2个月感染。该结果基本符合急性期感染实验室检测周期特征[15]，可认为该方法能推断感染时间[3]。用该方法对初检即确证的BL1596和BL2290进行进化分析，推断其感染时间分别为HIV抗体初筛有反应前14个月（2013年9月）和7个月（2015年7月），为慢性感染者。除BL1596以外的4例感染者均可以被认为是新发感染病例（1年内发生的感染并确证）。

XF053的感染时间与HIV抗体初筛有反应时间间隔偏长（4～5个月），可能与其感染的病毒毒株自身特征、感染后免疫反应引起血清学指标变化、疾病进展过快有关。XF053为蒙古族MSM感染者，感染B'亚型，且急性期存在WB带型波动；疾病进展迅速，CD4细胞计数呈动态变化特征：确证后首次检测CD4细胞计数为68个/µL，后升至227个/µL,1个月后又降至169个/µL，之后维持在300个/µL。XF053感染毒株的耐药特征也表现出准种病毒遗传学异质性，可能感染具有不同变异体的准种病毒而在体内呈现适应性改变，出现与东北地区MSM人群CRF01＿AE急性期病例类似的疾病快速进展现象[16,17]。

HIV-1是一个快速进化的RNA病毒，反转录酶易错配而缺乏校正功能、高效复制能力、体内毒株群体庞大和宿主免疫选择压力等多重因素导致了其进化动态特征[18]。gag基因体内进化速率为5.22×10-3替换/核苷酸/年，而env基因为8.39×10-3～1.58×10-2替换/核苷酸/年[8,18]。本研究5例病例的pol基因片段进化速率为1.67×10-3替换/核苷酸/年，略低于FENG等[9]报道的群体水平CRF01＿AEpol基因区进化速率3.25×10-3替换/核苷酸/年。

确证时CD4细胞计数通常是晚发现病例的判断依据：CD4细胞≤199个/µL提示感染8年及以上，200～349个/µL提示感染5～8年，350～449个/µL提示感染3～5年，≥450个/µL提示感染不到3年[5,19]。本研究中BL1596、XF151感染4年后，CD4细胞计数仍维持在500个/µL以上。但一些疾病进展较快的感染者CD4细胞计数下降较快，如XF053于感染后的早期阶段（3～6个月）维持较低的CD4细胞水平，属于疾病进展较快的免疫反应。有研究显示我国CRF01＿AE毒株感染者的疾病进展较快，59例急性期MSM病例中有45例（76.3%）在随访半年内CD4细胞计数快速降至350个/µL以下[17]；但在泰国的CRF01＿AE感染者研究中未发现此现象[20]。因此，对新发感染的判定或晚发现病例的分类宜结合病毒亚型和疾病进展综合判断。

贝叶斯合并理论一般用于某一地区群体水平毒株的流行趋势评估和传入时间分析[9,10,13]，而较少用于个体感染时间推断和进化分析[3,21]。本研究运用贝叶斯合并理论对随访感染者的HIV-1基因序列进行系统进化分析，推断感染时间，有助于评估新报告病例的新发感染发生水平和特征。本研究存在一定的应用局限性：需要对感染者进行随访且至少获得3个采样时间点的样本，并经RT-PCR扩增获得随访样本基因序列。用病例感染早期的序列信息来推断病毒起源时间或感染时间会更精确[8,11]。

文章来源：辛若雷,李佳,孙丽君,刘安,张琴,孙伟东,李洁,卢红艳,白立石.5例HIV-1感染者pol基因进化和感染时间推断研究[J].预防医学,2021,33(06):545-550.

基金：国家自然科学基金(81273136);北京市自然科学基金(7202074)