急性白血病( AL)是一种起源于造血干细胞的疾病，病情凶险，且易复发，病死率较高〔1〕。AL不同于实体肿瘤，血液肿瘤会随着血液流动而遍及全身，严重威胁患者生命安全。AL患者临床可表现为出血、贫血、发热等症状。急性淋巴细胞白血病( ALL)和急性髓细胞白血病( AML)是AL主要发病类型，后者的发病率较高〔2〕。巨噬细胞是一类具有迁移性及异质性的免疫细胞，巨噬细胞根据微环境的不同可分被极化成具有不同分子特异性及功能的亚群，主要可分为M1型和M2型。研究表明，M1型、M2型巨噬细胞可通过调控多种细胞因子，白细胞介素( IL) -10、肿瘤坏死因子( TNF) -α 等而发挥促癌或抑癌作用，并被证实与AL的发生、发展及预后关系密切〔3〕。磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，其可参与细胞增殖、凋亡及葡萄糖转运等。PI3K按照结构及功能的不同，主要分为3类，分别为异源二聚体、调节亚基及催化亚基。催化亚基中包含p110α、β、δ 及 γ，后面两种仅限于白细胞〔4〕。磷酸酶基因( PTEN)编码蛋白是具有磷酸酶及脂质磷酸酶活性，是第一个具有磷酸酶活性的抑癌因子。PTEN是PI3K/蛋白激酶B( AKT)负调控因子，在多种肿瘤中表达功能缺陷，其中包含AL〔5〕。Dectin-1是C型凝集素受体( CLＲ)家族成员之一，在免疫反应中发挥重要作用。随着对Dectin-1研究加深，发现其与肿瘤发生发展密切相关，在胰腺癌中表达上调并可调控巨噬细胞而促进肿瘤形成〔6〕。但Dectin-1在急性白血病中的作用还不清楚，故本文探究Dectin-1对急性白细胞活性、巨噬细胞相关因子及PTEN/PI3Kγ 信号的影响，以期为相关研究提供有利依据。

1、材料与方法

1. 1细胞来源及主要试剂

AL细胞K562(美国典型培养物保藏中心) ; Dectin-1 siＲNA和阴性对照siＲNA(上海吉玛公司合成) ;ＲPMI1640培养基(美国Biogrdetech公 司，货 号: A-CSH790) ;胎 牛 血 清( VivaCell公司，货号: C04001-050) ; PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002( Adooq Bioscience) ; PTEN抗体及CD68抗 体(艾美捷科技有 限公司，货 号:HPA031335、A-AO1453a) ; PI3K、AKT及辣根过氧化酶( HＲP)标记二抗兔(美国Cell Signaling Technology公司，货号: 3234、2920及7074) ; PI3Kγ 抗体(上海康郎生物科技有限公司，货号: KL10276Ｒ) ; GAPDH抗体〔中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;货号:ＲGA1040〕; CD163抗体(上海护实科技有限公司;货号: HK11128) ;流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司) ; CFX96Deepwell Dx实时荧光定量聚合酶链反应( PCＲ)系统〔伯乐生命医学产品(上海)有限公司〕;凝胶成像系统及Western印迹电泳系统(新加坡Invitrogen公司)。

1. 2细胞培养

K562细胞置于 ＲPMI1640培养基，于5%CO2、37℃饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养，按照1∶3进行传代，取对数生长细胞进行后续实验。

1. 3细胞转染Dectin-1基因特异性

siＲNA及无义片段( NC)均由上海吉玛制药技术有限公司设计，编码: CLEC7A-Homo-335。Dectin-1-siＲNA正 向 引物: 5'-GGGAAUCCUAUCAUUCCUATT-3'，反 向: 5'-UACCAAGCAUAGGAYYCCCTT-3'; Dectin-1-NCA正向引物: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。在37℃下孵育20 min，转染按照Lipofectamine2000说明书操作。

1. 4反转录实时荧光定量PCＲ 技术( qＲT-ＲCＲ)检测

K562细 胞 中Dectin-1 mＲNA 100μl细 胞 总ＲNA抽提试剂Trizol，进行摇晃，40μl的氯仿提取ＲNA，离心保留下方沉淀物，沉淀干燥，加入15μl的超纯水，待 ＲNA完全水解后，分光光度计检测ＲNA的 紫 外 吸 收 值 比 值。反 应 条 件: 95℃5 s，60℃30 s，40个循环，将提取的 ＲNA转录为cDNA，获得反体系10μl。采用2－ΔΔCt方法进行分析，引物序 列: Dectin-1正 向: 5'-GACTTGGCATTTACCTTGGG-3'， 反 向: 5'-TGAGGGTCAAATCGTGGC-3';GAPDH正向: 5'-GCCCTCAACGACCACTTTGT-3'，反向: 5'-TGGTGGTCCAGGGGTCTTAC3'。

1. 5分组

对照组( K562细胞)、NC组( K562细胞转染Dectin-1 NC)、Dectin-1 siＲNA组( K562细胞转染Dectin-1 siＲNA)、抑制剂组( K562细胞加入PI3K/AKT抑制剂LY294002( 20μmol /L)，Dectin-1 siＲNA+抑制剂组( K562细胞Dectin-1 siＲNA同时加入PI3K/AKT抑制剂LY294002( 20μmol /L)共培养。

1. 6噻唑蓝( MTT)检测细胞活性

K562细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔板，每孔中加入20μl的MTT试剂( 5 g /L)，分别在CO2培养箱中培养24、48、72及96 h，酶标仪在490 nm波长检测吸光度( A值)。

1. 7 Hoechst检测

K562细胞凋亡率K562细胞数目分别为1×105个接种于6孔板中，采用40 g /L的多聚 甲 醛 固 定30 min，TrintonX-100透 明，加 入5 mg /L的Hoechst荧光染色，蓝色颗粒荧光为凋亡细胞，ImageJ1．47i软件计算凋亡率。

1. 8流 式 细 胞 仪 检 测

各 组K562细 胞 中CD68、CD163的表达 各组细胞培养24 h后，细胞吹打后按照2 000 r/min离心，采用磷酸盐缓冲液( PBS)重悬细胞，加入抗体及5μl的异硫氰酸荧光素( FITC)膜联蛋白( Annexin)Ⅴ与5μl碘化丙啶( PI)混合后染色，无光孵育15 min后加入混合液，流式细胞仪检测，FlowJo7. 6软件进行数据分析。

1. 9 Western印迹检测

PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达 各组细胞加入胰蛋白酶进行消化，重悬细胞，浓度调整为1×106个/ml后，培养24 h，加入1ml NP-40冰上裂解30 min，4℃12 000 r/min，离心20 min，取上清液，用二喹啉甲酸( BCA)法测定蛋白浓度，在8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)上分离出蛋白质，然后转聚至聚偏氟乙烯( PVDF)膜上，封闭2 h后，加入一抗( 1∶200)，4℃摇床振荡孵育过夜后洗膜;加入辣根过氧化物酶标记的二抗( 1∶2 000)，室温孵育1 h后洗膜，用电化学发光( ECL)荧光试剂盒显色，压片显影，用Quantity One软件对各条带进行灰度分析，计算与GAPDH比值求得PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白的相对表达含量。

1. 10统计学分析

采用GraphPad Prism8软件进行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2、结 果

2. 1各组K562细胞中Dectin-1 mＲNA表达比较

与对照组、NC组相比，Dectin-1 siＲNA组、抑 制 剂组、Dectin-1 siＲNA+抑制剂组Dectin-1 mＲNA表达明显减少( P＜0. 05)。与Dectin-1 siＲNA组及抑制剂组相比，Dectin-1 siＲNA+抑制组Dectin-1 mＲNA明显减少( P＜0. 05)。见表1。

2. 2 MTT检测各组细胞活性

对照组与NC组的细胞在24、48、72及96 h的活性无明显差异( P＞0. 05)。与NC组相比，Dectin-1 siＲNA组K562细胞在24、48、72及96 h的活性明显降低( P＜0. 05)，Dectin-1 siＲNA组与抑制剂组细胞活性无明显差异( P＞0. 05)。与抑制剂组相比，Dectin-1 siＲNA+抑制剂组细胞活性明显降低( P＜0. 05)，见表1。

表1各组K562细胞24、48、72及96 h的活性、Dectin-1 mＲNA表达比较

2. 3 Western印迹检测各组K562细胞中PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达比较

对照组与NC组的K562细胞中PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达无明显差异( P＞0. 05)。与NC组相比，Dectin-1 siＲNA组PTEN表达明显增加，PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达明显降低( P＜0. 05)，Dectin-1 siＲNA组与抑制剂组以上指标无明显差异( P＞0. 05)。与抑制剂组相比，Dectin-1 siＲNA+抑制剂组细胞PTEN表达明显增加，PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达明显降低( P＜0. 05)，见图1、表2。

2. 4流式细胞仪检测各组细胞中M1型及M2型巨噬细胞标志物水平

对照组与NC组K562细胞中CD68、CD163的表达无明显差异( P＞0. 05)。与NC组相比，Dectin-1 siＲNA组CD68表 达 明 显 增 加，CD163表达明显降低( P＜0. 05)，Dectin-1 siＲNA组与抑制剂组细胞中CD28、CD163无明显差异( P＞0. 05)。与抑制剂组相比，Dectin-1 siＲNA+抑制剂组细胞CD68表 达 明 显 增 加，CD163表 达 明 显 降 低( P＜0. 05)，见表2、图2。

2. 5各组K562细胞凋亡率比较

对照组、NC组、Dectin-1 siＲNA组、抑制剂组、Dectin-1 siＲNA+抑制剂组的凋亡率分别为( 5. 24±0. 60 ) %、( 6. 00±0. 73) %、( 15. 25±2. 30 ) %、( 14. 68±2. 08 ) %及( 23. 60±3. 36 ) %，差异具有统计学意义( F =78. 960，P＜0. 001)。对照组与NC组K562细胞凋亡率无明显差异( P＞0. 05)，与NC组相比，Dectin-1siＲNA组凋亡率明显增加( P＜0. 05)，Dectin-1 siＲNA组与抑制剂组细胞凋亡率无明显差异( P＞0. 05)。与抑制剂组相比，Dectin-1 siＲNA+抑制剂组细胞凋亡率明显增加( P＜0. 05)，见图3。1～5:对照组、NC组、Dectin-1 siＲNA组、抑制剂组、Dectin-1 siＲNA+抑制剂组

图1各组K562细胞中PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达

表2各组K562细胞中CD68、CD163及PTEN、PI3Kγ、PI3K、AKT蛋白表达比较

图2流式细胞仪检测各组K562细胞中CD68、CD163表达

图3各组细胞凋亡( Hoechst荧光染色，×200)

3、讨 论

AL患者的临床治疗主要依靠化疗及骨髓移植等，超过80%的患者化疗后可完全缓解，但化疗可增加骨髓抑制及感染的风险，患者5年生存率不到40%〔7〕。而骨髓移植费用较高，需要考虑禁忌证、配型及移植物抗宿主等情况。目前，随着基因工程及分子生物技术的发展，发现多种基因或蛋白在AL患者外周血中表达异常，与疾病进展存在关联。Dectin-1作为一种跨膜c型凝集素，主要参与对真菌病原体的先天免疫反应，但是随着对其研究加深，认为其与肿瘤的发展存在关联。细胞增殖及凋亡是生命体重要的特征之一，受到机体调控。当发生AL时细胞增殖调控失衡，凋亡减少，促使恶性增殖，导致癌细胞不断自我复制及扩张，影响机制造血功能〔8〕。癌症的发生发展与多因基因相关，Dectin-1在癌症的发生发展中具有双重作用，认为其在胰腺癌细胞中表达升高，可加快疾病进展，其表达缺失具有保护作用。但也有研究认为在黑色素瘤中上调Dectin-1可通过上调IL9表达而发挥抗肿瘤效应〔9〕。

本研究结果说明，抑制Dectin-1可控 制 疾 病 进 程。Dectin-1也 被 称 为CLEC7A，以往研究表明，CLEC7A在AML患者表达增加，通过设计shＲNA并进行慢病毒转染后，细胞增殖显著受到抑制并可加快细胞凋亡，研究机制认为 是 通 过 对 凋 亡 关 键 因 子B细 胞 淋 巴 瘤( Bcl) -2及Bcl-2相关X蛋白( Bax)等进行调控，进而加快凋亡〔10〕。

本文研究结果与之一致。研究机制可能在于Dectin-1通常具有抗真菌免疫功能的作用，但免疫细胞会以某种方式对真菌微生物产生过度反应，过量的Dectin会促进肿瘤生长，因为其拥有招募免疫抑制性细胞的能力，而加快肿瘤的发生发展。巨噬细胞是免疫系统中重要组成部分，可通过吞噬及分泌相关因子在固有免疫及适应性免疫中发挥作用〔11〕。在AL肿瘤微环境中巨噬细胞可受到病理信号的影响，表达出高度的异质性，发挥特定的调节作用〔12〕。有学者对AL患者骨髓中巨噬细胞进行研究，发现在初诊AL患者骨髓中均存在着CD68及CD163异常浸润，其中以M2型巨噬细胞CD163为主，提示在AL患者中M2型巨噬细胞表达升高，并可能通过自分泌或旁分泌的方法参与癌细胞的恶性增殖及凋亡抵抗作用〔13〕。本文研究结果说明，M2型巨噬细胞减少，M1型巨噬细胞增多，降低Dectin-1可实现M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的逆转。Dectin-1是选择性表达在骨髓-单核细胞系(包括巨噬细胞)的模式识别受体，可通过激活核因子( NF) -κB等信号通路参与调节固有免疫〔14〕。Daley等〔15〕以Dectin-1为靶点对人胰腺导管腺癌病例及小鼠胰腺导管腺癌( PDA)模型进行了相关研究，发现Dectin-1高表达于胰腺癌小鼠胰腺导管腺癌( PDA)模型巨噬细胞中，反之，当敲除后Dectin-1后可通过减少T细胞抑制作用而发挥抗肿瘤效应。本文推测在AL细胞中敲低Dectin-1后，M2巨噬细胞的活性受到抑制，M1型巨噬细胞升高，进一步发挥抗AL的作用。PI3Kγ 是P13K家族蛋白成员，具有体调节中性粒细胞及免疫逃逸等作用进而影响肿瘤的生长及转移〔16〕。有研究表明，在胰腺癌细胞中，PI3Kγ 可通过调 控 巨 噬 细 胞 活 性 而 促 进 癌 细 胞 活 性〔17〕。PTEN是PI3K/AKT信号通路的负调控因子，可加快底物二磷酸磷脂酰肌醇( PIP2)水解，进而抑制PI3K信号通过活性〔18〕。本研究结果说明，当Dectin-1受到抑制后PI3K、AKT等蛋白活性降低，说明Dectin-1对PI3K、AKT等具有调控作用。在小鼠树突细胞中Dectin-1具有杀伤白色念珠菌活性的作用，认为是通过增加氧自由基的表达而发挥作用，并认为氧化应激依赖于脾酪氨酸激酶( Syk)、PI3K、磷酸肌醇依赖蛋白激酶1和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADPH)氧化酶，认为Dectin-1对上述信号具有调控作用〔19〕。在免疫系统中发现toll样受体( TLＲ) 2 /1异二聚体与Dectin-1联合，通过PI3K途径启动信号，最终激活抗炎作用〔20〕。本文认为，Dectin-1受到抑制，PI3K表达降低，进而PTEN活性升高，与PI3K/AKT抑制剂作用相似，但是具体机制还需要进一步探讨。

综上，下调Dectin-1表达可显著抑制AL细胞活性，促进凋亡，同时可促使M2型巨噬细胞向M1型转化进一步发挥抗肿瘤作用，研究机制与激活PTEN及抑制PI3Kγ 表达相关。

参考文献:

3杨娇.肿瘤微环境在白血病､淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究〔D〕.济南:山东大学,2022.

7张巧艳,吕夏晔,王 艳 芝,等.急性白血病患者化疗间隔时间与预后的相关性分析〔J〕.中国实验血液学杂志,2021; 29( 3) : 709-14.

10林凡琳. CLEC7A对急性髓系白血病细胞增殖分化的影响及作用机制初探〔D〕.大连:大连理工大学,2019.

13宋建新,欧阳红梅,闻艳,等.急性白血病相关巨噬细胞的性质及rhIFN-γ对其影响的研究〔J〕.重庆医学,2019; 48( 19) : 3292-6,3302.

14徐红艳.慢病毒介导的Dectin-1过表达及Curdlan在巨噬细胞RAW264. 7对抗马尔尼菲篮状菌感染中的作用〔D〕.南宁:广西医科大学,2018.

文章来源:武晓静,张平,左安兰.Dectin-1/介导巨噬细胞对急性白血病细胞活性及PTEN/PI3Kγ信号通路的影响[J].中国老年学杂志,2025,45(03):716-720