近年来,广谱抗生素在临床上的使用越来越广泛,导致细菌对各种广谱抗生素的耐药性也随之越发严重,尤其是碳青霉烯类药物,如:亚胺培南、美罗培南或厄他培南的广泛应用使碳青霉烯耐药肠杆菌(CRE)的检出随之逐年上升,因此,治疗碳青霉烯耐药的肠杆菌引起的感染成为临床抗感染的难题,导致产生CRE的机制复杂且形式不一,但业界主要还是将目光多集中于菌株产碳青霉烯酶上。此类酶可以使碳青霉烯类抗生素水解,失去抗菌活性,并且此类酶的编码基因常常存在于质粒、转座子、整合子等可移动单元上,可以在不同菌株间传播,从而造成耐药菌株在不同病人及病区间播散。针对不同的基因型,临床采取的治疗措施也会有所不同。因此,要求实验室能够快速、准确地鉴别出CRE的基因型,为临床及时、有效地抗感染治疗提供依据。碳青霉烯酶型的检测方法主要包括表型检测及分子学检测,分子学检测技术需要特定的人员及设备。随着检验技术的不断进步,最近新上市的检测试剂NG-TestCarba-5碳青霉烯酶检测条,采用双抗体夹心法的胶体金免疫层析技术可以在15min内检测出5种碳青霉烯酶基因型。改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)和EDTA改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)法是CLSI推荐的作为CRE表型筛查的方法。本研究以亚胺培南或厄他培南耐药的肺炎克雷伯菌(CarbapenemresistantKlebsiellapneumoniae,缩 写 为 “CRKP”)为 研 究 对 象,探 讨mCIM与eCIM联合试验检测碳青霉烯酶的临床应用价值。

1、材料和方法

1.1菌株来源

本院临床微生物室从临床各科室2021年1月至2023年5月 送 检 的 所 有 标 本 中 分 离 的76株CRKP(去除重复菌株),主要来源于神经内科(30株)、重症医学科(25株)、神经外科(12株)、肿瘤科(5株)、血液科(4株)。痰标本70例,无菌体液6例。标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、阳性质控菌株肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705及ATCCBAA-2146、阴 性 质 控 菌 株 肺 炎 克 雷 伯 菌ATCCBAA-1706为本室所藏。

1.2主要设备与试剂

有ZF-208凝胶成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司),电泳仪(北京六一生物科技有限公司),VITEK2compact细菌鉴定及药敏分析系统(生物梅里埃公司),Hema9600基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司),DNA marker(北京天根生物公司),美罗培南药物敏纸片(10μg)(英国Oxoid公司),药 敏 用 水 解 酪 蛋 白 平 板、胰 蛋 白 胨 肉 汤(TSB)、哥伦比亚血平板(济南百博生物技术有限公司),乙二胺四乙酸为安医大一附院微生物室惠赠,PCR扩增试剂购自大连宝生物工程有限公司,引物由上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1碳青霉烯酶基因检测

参考胡炜明[1]506-511、张青[2]、尹娟[3]等作者的文献 设 计 引 物,引 物 序 列 见 表1,用 细 菌 基 因 组DNA提取试剂盒制备细菌DNA模板。PCR扩增体系 为[4]99-102:反 应 体 系 中 含 有 上 游 引 物0.4μmol/L、下游引物0.4μmol/L,目的基因模 板5μL,总反应体积为50μL。参数设置[4]99-102:95℃预变性4min;95℃45s,56℃60s,70℃60s,共循环35次;最后72℃延伸10min。扩增后获得的阳性产物,经纯化试剂盒纯化后进行双向测序,用测序 后 获 得 的 基 因 序 列,采 用GenBank中 的BLAST程序进行比对分析。

表1碳青霉烯酶基因引物序列及扩增产物长度基因名称

1.3.2 mCIM和eCIM试验

试验方法及结果判读参 照 美 国CLSIM100-S32[5]推荐方法:(1)mCIM试验 用1μL接种环取血平皿过夜培养的待测菌接种至2mLTSB中,漩涡震荡10~15s,将1张10μg美罗培南纸片加入到菌液管中,35℃孵育4h;在4h的孵育完成时,用0.9%的生理盐水制备 菌 悬 液,选 用 的 菌 株 是ATCC大肠埃希菌25922,配置浓度为0.5个麦氏浓度,将配备好的菌悬液均匀地涂布在MHA平皿上,室温放置10min,贴上美罗培南纸片,倒置后放入35℃孵育箱,孵育24h后,量取抑菌环直径。抑菌环直径在6~15mm或在16~18mm抑菌环内有细小的菌落生长,可判断为碳青霉烯酶阳性;抑菌环直径≥19mm,判断为该株细菌不产碳青霉烯酶;抑菌环直径16~18 mm,或 抑 菌 环 直 径 ≥19mm但抑菌环内存在针尖样菌落,碳青霉烯酶不确定。(2)eCIM试验:mCIM试验的同时,标记第二个2mLTSB管,向2mLTSB管中加入0.5 M浓度的EDTA20μL,EDTA终 浓 度 为5 mM;用1μL接种环取血平皿过夜培养的待测菌接种至含20μL0.5M EDTA的TSB管中,漩涡震荡10~15s,将1张10μg美罗培南纸片加入到菌液管中,35℃孵育4h;孵育完成后取出美罗培南纸片,与mCIM试 验 中 涂 有 美 罗 南 敏 感 大 肠 埃 希 菌ATCC25922的同一块平皿上,同时,做阳性质控,倒置,35℃ 孵 育18~24h,量 取 抑 菌 环 直 径。eCIM和mCIM试验抑菌环直径相差≥5 mm,判断为产金属β-内酰胺酶;eCIM和mCIM试验抑菌环直 径 相 差 ≤4 mm,则 金 属 β-内 酰 胺 酶 阴性。[6]35-39(3)mCIM与eCIM联合试验结果判定:mCIM试验结果为阳性、eCIM试验为阴性时,可判断为该株细菌产丝氨酸型碳青霉烯酶;mCIM试验如果为阳性、而eCIM试验结果为阳性,则可判断为此株细菌产金属型 β-内酰胺酶;如果mCIM试验结果为阴,那么,无论eCIM试验结果如何,均判定该株细菌不产碳青霉烯酶。

1.4统计学分析

采用统计学软件SPSS20.0对试验数据进行处理,以PCR基因检测结果为对照,计算mCIM和eCIM检测丝氨酸碳青霉烯酶及金属β-内酰胺酶的敏感度、特异度,以及这两种试验方法的阳性预测值和阴性预测值。计算公式[7]分别是:敏感度的计算公式:真阳性例数与真阳性例数及假阴性例数之和的比值乘100%;特异度的计算公式:真阴性例数与真阴性例数及假阳性例数之和的比值乘100%;阳性预测值的计算公式:真阳性例数与真阳性例数及假阳性例数之和的比值乘100%;阴性预测值的计算公式:真阴性例数与真阴性例数及假阴性例数之和乘100%。采用Kappa检验进行一致性分析,Kappa值在0.75~1.0,一致性高。

2、结果

2.1碳青霉烯酶基因检测结果

76株CRKP中73株检出碳青霉烯酶基因,其中:blakpc-2阳性59株,blaNDM-2阳性9株,blaIMP-4阳性3株,blaVIM-2阳性1株,blaKPC-2与blaIMP-4同时阳性1株,未检出blaOXA-48耐药基因。

2.2 mCIM和eCIM试验结果

73株PCR方法检测碳青霉烯酶基因阳性肺炎克雷伯菌,mCIM试验全部阳性,即73株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌mCIM试验阳性,无阴性株;73株平行eCIM试验株检测结果,其中阳性13株,阴性60株;1株同时携带blaKPC-2与blaIMP-4肺炎克雷伯菌mCIM试验阳性,而eCIM试验阴性,结果见表2。

表2 PCR法及mCIM联合eCIM试验检测碳青霉烯酶结果

2.3 mCIM检测碳青霉烯酶结果分析

73株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,mCIM试验全部阳性,即mCIM试验检测碳青霉烯酶的敏感度及特异度均为100%,阳性预测值和阴性预测值也均为100%,Kappa值为1.000,与PCR基因检测结果比较一致性高与国内报道一致。[8]

2.4 mCIM与eCIM联 合 检 测 碳 青 霉 烯 酶 结 果分析

mCIM与eCIM联合检测碳青霉烯酶,mCIM试验阳性,同时eCIM试验阴性,为产丝氨酸碳青霉烯酶,敏感度与特异度均为100%,阳性预测值100%,阴性预测值100%,Kappa值为1.000,与国内文献报道相似[1]510;mCIM与eCIM联合检测碳青霉烯酶,mCIM试验阳性,同时eCIM试验阳性,为产金属β-内酰胺酶,敏感度为93.3%,特异度为100%,阳 性 预 测 值100%,阴 性 预 测 值98.4%,Kappa值为0.954,Kappa值均大于0.75,与PCR基因检测结果一致性高。

2.5碳青霉烯酶不同酶型在临床科室的分布情况

碳青霉烯酶不同酶型在临床科室的分布情况为:重症医学科blakpc-2型25株,blaVIM-2型1株,同时携带blaKPC-2与blaIMP-41株;神经内科blakpc-2型17株,blaNDM-2型 型6株,blaIMP-4型1株;神 经 外 科blakpc-2型10株,blaIMP-4型2株;肿瘤科blakpc-2型4株,blaNDM-2型 型2株,血 液 科blakpc-2型3株,blaNDM-2型 型1株。由 此 可 见,我 院 流 行 的 主 要 为blakpc-2型碳青霉烯酶。

3、讨论

用于肠杆菌科细菌感染的抗菌药物种类繁多,作用效果不一而足。特别是随着细菌耐药率的增加,碳青霉烯类抗生素逐渐受到临床医生的青睐。但正是由于此类抗生素在临床的使用越来越多,不但增加了病人的经济负担,而且使得此类抗生素耐药的菌株不断出现,尤其是CRE在近几年的检出率也在不断攀升,CHINET对碳青霉烯类抗生素的耐药率中国细菌耐药监测网显示,我国临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率从2005年的3%上升到2021年的23%以上,达到了8倍[9],使其逐渐成为抗感染治疗的又一棘手的难题。国外的一项研究表明:感染产酶型碳青霉烯耐药肠杆菌的患者入院14d病死率超过非产酶型碳青霉烯耐药肠杆菌患者的4倍。分子生物学方法虽然是检测耐药基因的金方法,但因其试剂成本高,需要特殊的设备,对人员有较高的要求,使其无法在临床实验室广泛使用,尤其是基层实验室。因此,在有限资源条件下,临床亟需找到一种简便、快速、准确的CRE表型筛选方法。改良Hodge就是试验其中之一,这一试验是由CLSI于2009年提出,用于检测肠杆菌科细菌是否产生碳青霉烯酶;CarbaNP试验是CLSI引入的又一检测碳青霉烯酶表型的方法,这一方法于2012年提出,主要用于肠杆菌科、铜绿假单胞菌和不动杆菌属细菌;后来也有学者尝试使用EDTA双纸片增效试验等方法用于检测碳青霉烯酶。但这些方法往往要么操作繁琐且灵敏度低,要么试剂不稳定且价格较高,不利于常规实验室开展工作。CLSI于2017年推出了mCIM法作为肠杆菌科细菌筛选碳青霉烯酶的试验。2018年CLSI又推出了EDTA碳青霉烯灭活试验eCIM,其操作简单,不需要过多的试剂,成本较低,非常便于临床实验室的应用。

本研究依据最新 版CLSI M100-S32推 荐 的 方 法,研 究 探 讨mCIM和eCIM联合试验在检测产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中的应用价值。mCIM试验原理是耐药菌产生的碳青霉烯酶能水解药敏纸片上的美罗培南,使美罗培南失去活性,无法抑制ATCC25922生长;eCIM试验原理则是加入的EDTA能够与金属β-内酰胺酶中的金属离子相结合,破坏了金属酶的活性,使得美罗培南的抗菌活性得到保护。研究结果表明,mCIM作为肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药表型筛选方法,筛选产碳青霉烯酶的敏感度与特异度均达到100%,与国内相关研究结果一致。[1]510结合eCIM试验,可以检测出丝氨酸碳青霉烯酶和金属 β-内酰胺酶。检测 丝 氨 酸 碳 青 霉 烯 酶,敏 感 度 与 特 异 度 均 为100%;检测产金属β-内酰胺酶,敏感度为93.3%,特异度为100%,与国内学者唐克文等[6]38的研究结果检测金属β-内酰胺酶敏感度为84.8%不同,而与其他学者[1]510一致。本研究73株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中,丝氨酸碳青霉烯酶(blaKPC-2)最多,占82.19%,说明丝氨酸碳青霉烯酶(blaKPC-2)是本院肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南耐药的主要机制,与国内作者黄晓琳[10]及沈芳[11]报道的绍兴地区一致。值得注 意 的 是,1株 同 时 携 带blaKPC-2与blaIMP-4基因的耐药株,mCIM试验阳性,而eCIM试验阴性,未检测出金属β-内酰胺酶,可能是由于两种酶特征不同而导致了eCIM试验结果出现假阴性。

因此,对于同时产丝氨酸碳青霉烯酶和金属β-内酰胺酶的菌株,eCIM试验具有局限性。建议对于产丝氨酸碳青霉烯酶的菌株,应采取其他 方 法 进 行 复 测,如 采 用NG-TestCarba-5方法,以避免造成假阴性。有数据表明NG-TestCarba-5能准 确 检 测 出KPC、OXA-48-like、NDM和IMP四类碳青霉烯酶,而且检测时间最短,15min即可出检测结果,且操作简便,适合临床快速诊断。但目前因为试剂价格比较昂贵,因此,还无法在基层实验室普遍开展。试验中,有3株CRKP未检出碳青霉烯酶耐药基因,这是由于肠杆菌科细菌对此类抗生素的耐药机制繁多,涉及因素广泛,除了最主要的耐药机制是产碳青霉烯酶,此外,可能还涉及到细菌外膜孔蛋白的缺失或突变使得碳青霉烯类抗生素不能通过细胞膜的转运进入细菌体内,难以发挥抗菌作用;细菌高产ESBLs或头孢菌素酶(AmpC)可以快速水解碳青霉烯类抗生素也是其中因素之一。由于本研究主要针对的是碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌,耐药基因主要为KPC和NDM型,mCIM联合eCIM试验有着较好的筛选效能,与PCR检测耐药基因的金方法相比,具有高度一致性。另外,研究中收集的CRKP大部分来源于痰液,很难区分感染与定植。因此,应建议临床多送无菌体液作为检测样本。这就要求检验与临床要加强沟通与交流,把无菌体液才是微生物检验最有临床意义的样本这个概念印刻在临床医生的脑海中,并通过临床检验手册、临床样本采集与运输手册、临床与检验学术沙龙等方式加以贯彻实施,才能更好地反应出医院真实的细菌耐药情况。

综 上 所 述,本 研 究 数 据 显 示,mCIM联 合eCIM试验作为一种肺炎克雷伯菌检测产酶株表型的筛选方法,具有操作简单、结果易于判读、成本低、敏感度与特异度高等特点,适用于大多数临床实验室,特别是基层实验室开展,可为临床感染治疗及医院感染控制提供快速、准确的依据。

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文章来源:程丽,姚慧琳,陈欣悦.mCIM联合eCIM试验检测产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的临床应用[J].淮北职业技术学院学报,2025,24(01):113-116.