急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中一个独特的M3亚型。早幼粒细胞中含有大量的嗜天青颗粒，其内富含弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)和组织蛋白酶G(cathepsin G,CatG),这是APL区别于其他AML的形态学基础[1,2]。NE和CatG均属丝氨酸蛋白酶家族，以往研究多关注于这两种酶的抗菌活性，并在既往研究中发现APL患者外周血及骨髓血中含有高表达的NE及CatG[3,4],且研究者多采用CatG调控序列表达PML-RARα的原癌基因构建APL的小鼠模型[5],说明NE及CatG与APL的相关性。现从APL的定义-“颗粒增多的早幼粒细胞”出发，对APL中NE及CatG的研究进展进行综述。

1、NE与APL的发生

APL最常见第15、17号染色体基因断裂易位形成PML-RARα融合基因，然而这种异常本身并不能触发APL,PML-RARα融合基因继发的协同事件可能参与了APL的发病机制[6,7]。PML基因定位于人类15q22染色体上，其包含核定位信号(nuclear localization signal, NLS)、B盒和α-螺旋线圈区[8]。许多研究已经证实PML-RARα融合蛋白存在切割位点，NE、CatG均可对其切割，但以NE为主，NE可切割其为成两个变异体，分别为无NLS的PML,即PML(NLS-)蛋白和保留NLS的NLS-RARα蛋白[9]。已有研究证明，在动物早期髓系细胞中转入PML-RARα融合基因可导致APL的发生，而将PML-RARα导入无NE的早期髓系细胞后，PML-RARα未被切割，发生APL的概率低于之前观察到的情况[10],说明NE在APL触发中起到了重要的作用，下面从NE切割PML-RARα融合蛋白产生的PML(NLS-)蛋白及NLS-RARα蛋白两方面综述其对APL发生的可能影响。

1.1 PML(NLS-)蛋白可抑制细胞凋亡

NLS区域在蛋白质的核定位中起着重要作用，NLS的异常或缺失可能会诱发疾病。GAO等[11]构建了shRNA沉默PML(NLS-)的pPML(NLS-)-shRNA及过表达PML(NLS-)的重组腺病毒pAd-PML(NLS-)感染APL细胞株HL-60细胞，观察得出HL-60/pPML(NLS-)-shRNA的增殖受到明显的抑制，细胞凋亡率明显升高，相反HL-60/pAd-PML(NLS-)的增殖明显增强，细胞凋亡率明显下降，这些结果表明PML(NLS-)能促进HL-60细胞的增殖，抑制其凋亡。

与白血病细胞凋亡相关的基因有很多，包括c-myc基因、bcl-2基因家族等。c-myc基因是myc癌基因家族的重要成员，其编码的核蛋白定位于细胞核内发挥作用，对细胞凋亡的影响有双重作用，在病理条件下c-myc基因过度表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。bcl-2基因家族同样是调节细胞凋亡的成员之一，经常作为肿瘤治疗的靶点，在凋亡相关基因中，bax和bcl-2是一对作用相反的基因，bax高表达可拮抗bcl-2的凋亡抑制作用，bax/bcl-2比值与细胞凋亡密切相关[12]。为研究PML(NLS-)对APL细胞凋亡的影响机制，检测了凋亡相关基因的mRNA和蛋白质表达，发现PML(NLS-)细胞c-myc、bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达明显增加，而bax表达明显减少，bax/bcl-2比值下降[9],提示PML(NLS-)可促进c-myc、bcl-2的表达，抑制bax的表达从而抑制细胞凋亡。PML(NLS-)与野生型PML不同，人类野生型PML作为肿瘤生长抑制因子，可以抑制细胞生长，促进细胞凋亡[13],野生型PML分布于PML细胞核内，可与肿瘤抑制因子p53、Daxx、p300及其他核内物质相互作用[14],但PML(NLS-)由于NLS的缺失，将从细胞核转运到细胞质中[15]。由此推测，离开细胞核的PML(NLS-)可能失去了与核内因子的相互作用，并且PML(NLS-)可影响白血病细胞凋亡相关基因的表达，产生了与野生型PML不同的生物学效应，这可能是NE切割PML-RARα产生的PML(NLS-)抑制APL细胞凋亡的途径。

1.2 NLS-RARα蛋白可抑制细胞分化

1.2.1 NLS-RARα蛋白与RA信号通路的紊乱

维甲酸(retinoicacid, RA)信号通路在调节造血干细胞的发育及其分化为不同的造血细胞系中起着至关重要的作用[16,17]。RARα作为RA信号通路的重要组成部分，是一种配体依赖的转录因子，通常与维甲酸受体(RXRs)结合为异二聚体后，再与靶基因启动子上的维甲酸反应元件(RAREs)结合调控RA靶基因的转录[18]。维甲酸受体β(RARβ)和CEBPε是典型的RA靶基因，DNA甲基化分析结果表明，RARβ的CpG岛高甲基化与白血病预后不良相关[19],CEBPε的过度表达可促进APL细胞分化[20,21],并且在APL应用全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(ATO)治疗期间，CEBPε的表达迅速升高，使APL的治愈率提高[22,23],再次说明RA信号通路可能与APL分化抑制、成熟停滞有关。

LI等[24]构建了NLS-RARα过表达的APL细胞株NB4细胞，发现与对照组相比，NLS-RARα过表达组RARβ和CEBPε的转录翻译显著下降，当用RARα选择性拮抗剂AR7处理NB4细胞后得到结果与NLS-RARα过表达组相同，当用RARα选择性激动剂AM580处理时，RARβ的表达上调。这些结果可以表明NLS-RARα能抑制RARα靶基因的表达，由于NLS-RARα与RARα都主要存在于细胞核中，根据核定位重叠推测NLS-RARα与RARα可竞争结合RXRs, NLS-RARα-RXRs异二聚体定位于RAREs并招募辅助抑制因子SMRT,导致RA靶基因受到抑制，从而影响RA信号通路。

1.2.2 NLS-RARα蛋白与细胞周期的紊乱

终末分化通常与细胞周期有关，细胞周期的调控主要是通过磷酸化和去磷酸化为基础的细胞周期蛋白(Cyclin)-细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)-细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CDK inhibitor, CKI)途径实现[25]。当细胞异常增殖时，CKI可与CDK或Cyclin-CDK结合，抑制CDK使细胞周期停滞，避免肿瘤的发生，p19与p21分别作为最常见的INK4家族和Cip/Kip家族的CKI,对CDK有强烈的抑制作用。研究发现，多种信号通路可调控CKI的表达，CKI在参与调节细胞分化的同时在白血病等多种恶性肿瘤的发病机制中起着重要的肿瘤抑制作用[26]。

PML-RARα通过直接结合启动子并反式抑制其转录来降低p19和p21,说明p19和p21在APL中的作用[27]。p19和p21通过抑制CDK,阻止RB家族蛋白的磷酸化来间接抑制转录，RB蛋白磷酸化是细胞周期的关键事件，通过连续磷酸化使细胞由G1期进入S期。XIONG等[28]检测了NLS-RARα过表达后的APL细胞株HL60细胞和淋巴瘤细胞株U937细胞，发现p19和p21降低，Cyclin D1和Cyclin E1表达增加，RB蛋白无明显变化，PRB蛋白显著升高。Cyclin D1和Cyclin E1是G1期晚期的关键因子，细胞周期的G1期晚期是细胞分化和成熟的关键时期，它们在多种癌症中经常过度表达，G1期缩短，导致肿瘤进展加快[29]。由此，可以推测在APL中NLS-RARα的表达可能直接影响p19与p21的水平，间接导致Cyclin D1及Cyclin E1活性的升高，依次增加RB蛋白磷酸化，从而使细胞摆脱G1/S检测点的调控引起细胞周期紊乱，细胞过度增殖、分化受限。

2、CatG与APL的关系

CatG最先在中性粒细胞的嗜天青颗粒中被发现，随后在B细胞、人类原代单核细胞、树突状细胞中，甚至，近年来研究证明中性粒细胞胞外诱捕网和外泌体中也存在CatG[30]。CatG基因的表达主要限于髓系细胞，并且其发育受调节，在早幼粒细胞阶段达到高峰，随着中性粒细胞的成熟，早幼粒细胞中高水平的CatG逐渐减少[31]。

2.1 CatG通过切割BRM蛋白，参与细胞凋亡

SWI/SNF染色质重塑复合物可调控AML细胞，对APL样本的突变分析发现了编码SWI/SNF复合物的基因突变[32],BRM蛋白作为SWI/SNF复合物的核心ATP酶，其编码基因为SMARCA2,参与调节染色质的结构，SMARCA2的表达降低或基因突变与多种恶性肿瘤的发生密切相关，并经常在肿瘤进展中被破坏[33],已有充分的证据表明BRM蛋白在胃癌、肺癌等恶性疾病中起着至关重要的作用[34],但其在白血病中的研究才刚刚开始探索。

BRM蛋白是在静止的造血干细胞中表达的主要ATP酶，这表明BRM的丢失是在白血病发展时发生的，DOMENECH等[35]研究支持了这一假说，并首先发现了白血病细胞中SMARCA2基因的突变。含有BRM的SWI/SNF复合物调控许多与癌变有关的基因表达，包括细胞周期相关基因CCND1(Cyclin D1)、CCNE2(Cyclin E2)、CDK4及CDK6,BRM可与RB蛋白及其家族成员相互作用影响细胞周期[36]。在通过紫外线照射、DNA损伤剂或星形孢菌素诱导凋亡后，BRM蛋白在APL细胞株NB4细胞中被切割，CatG被发现在NB4细胞的凋亡过程中可以切割BRM调节其降解，而已知的Caspase 3,6,7等却对BRM无效[37],这一发现说明了CatG对于BRM的重要作用。由于BRM丢失的小鼠细胞比正常小鼠细胞更容易受到紫外线照射诱导凋亡[38],所以在一定程度上BRM蛋白可对抗紫外线照射诱导的细胞凋亡。具有降解BRM蛋白机制的细胞，例如存在大量CatG的APL细胞，可能对细胞凋亡更为敏感，并且CatG切割BRM蛋白可能对细胞周期产生影响。目前对于SWI/SNF染色质重塑复合物在白血病中的机制正在不断研究，而APL中存在的大量CatG可对BRM蛋白进行切割，可以推测CatG对于APL的发生发展有着重要意义。

2.2 CatG在APL出血倾向中的作用

在临床上APL通常表现为较其他白血病更为严重的出血倾向，甚至发展至弥散性血管内凝血，随着ATRA和ATO治疗方式的加入，APL患者的治愈率显著提高，但早期出血性死亡仍然是治疗失败的主要原因。关于APL凝血紊乱的机制十分复杂，且其一直为讨论热点，目前针对APL凝血紊乱的研究主要包括凝血通路激活和纤溶亢进[39],同时中性粒细胞中蛋白酶的作用也在不断被提出[40]。

中性粒细胞以CatG依赖性方式在体内调节血小板活化和血栓形成，FARADAY等[41]利用小鼠模型验证了这一假说，确定了CatG可促进血小板的体外聚集并可作为抗血栓形成潜在的治疗靶点。同时，针对CatG在血管通透性中的作用研究较多，CatG可影响细胞形状，并在内皮细胞间引起细胞间隙的形成，降解血管内皮细胞钙黏蛋白，增加其通透性，确切的机制可能与破坏钙稳态平衡有关，磷酸肌醇增加和蛋白激酶C活化增加了穿过内皮细胞单层屏障的白蛋白[42],内皮细胞屏障的破坏可引起APL细胞的浸润及迁移，不仅可以引起出血倾向，还可导致流体渗入肺泡腔引起APL分化综合征[43]。并且，CatG以剂量和时间依赖性方式诱导基质金属蛋白酶2的活化，损伤微血管系统，从而在肿瘤侵袭和血管生成中发挥作用，CatG对基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶10的激活也参与了毛细血管退化[44]。所以，CatG增加血管通透性的机制可能是通过降解细胞外基质成分或活化基质的金属蛋白酶直接或间接影响组织重塑，在败血症、急性肺损伤、脑水肿等多种疾病中发现血管通透性增加，CatG可能参与了这些疾病的发生和发展，而其在APL中出血倾向的具体的分子机制仍需进一步研究。

2.3 CatG作为免疫治疗靶点

针对异常表达的白血病相关抗原的免疫疗法是AML的新型疗法之一。然而，由于髓系白血病的特征是具有异质性和克隆进化，靶向单肽表位的效果有限，突出了对新型白血病相关抗原探索的需求。已有研究证明CatG可作为一种新型白血病相关抗原[45],它在包括APL在内的AML细胞以及白血病干细胞中高表达，在正常的造血干细胞中不表达，由于蛋白质泛素化促进了蛋白酶体的降解以便在MHC-I类分子上加工[46],对CatG进行了研究证明其同样在AML中泛素化，促进了CatG衍生肽在白血病细胞表面的呈递，其中CatG1肽是一种天然加工的具有免疫原性的CatG衍生肽，CatG1-CTL可裂解AML细胞，而对正常骨髓细胞的杀伤作用很小，可能原因为正常骨髓细胞表达的CatG1肽水平较低[47]。ALATRASH等[48]对CaG在AML患者中的预后进行了分析，数据显示CatG水平与总生存期(overall survival, OS)之间存在显著关联，CatG低水平患者的OS明显优于CatG高水平患者。CatG在多种AML亚型中尤其是APL中高度表达，因此推测CatG可能为APL理想的白血病相关抗原。但是CatG在APL中的应用价值如何、是否存在其他比CatG1更有效的CatG衍生肽、靶向CatG的方式如何影响体内造血功能?关于CatG的靶向治疗仍需不断研究。另外除CatG以外的其他组织蛋白酶同样被证明在APL中的作用，ATO是APL有效的治疗药物，其机制之一是可诱导组织蛋白酶L的释放有助于PML-RARα融合蛋白的降解[49]。对组织蛋白酶家族的研究为APL的发生机制和相关的治疗方向提供了有价值的见解，CatG的发现增加了白血病相关抗原库，可以通过免疫疗法来靶向治疗白血病和其他可能的肿瘤。

3、小结

APL是AML一个独特的亚型，其具有特殊的细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学特征和区别于其他AML的临床表现，ATRA和ATO的发现大幅提高了APL的治疗效果。近年来，对于NE和CatG的研究证实了其与APL的发生发展及靶向免疫治疗的相关性。NE可切割PML-RARα融合蛋白产生的变异体影响APL发生，而CatG与APL独特的出血倾向相关，并可作为新型白血病相关抗原从而进行靶向治疗，说明关于APL的研究仍需不断探索，以提高NE、CatG在APL中的重要临床应用价值。

文章来源:修若琳,隋美娟,张卓等.急性早幼粒细胞白血病中弹性蛋白酶和组织蛋白酶的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):3118-3122.