急性髓系白血病（AML）为起源于髓系造血干/祖细胞的高度异质性血液恶性肿瘤，化疗、造血干细胞移植及靶向药物的发展使AML疗效不断优化，但目前成人AML 5年生存率仅28.3%，免疫治疗的兴起为AML患者提供了更多治疗选择[1,2]。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）是近年来细胞免疫治疗领域的研究热点[3]。CAR-T细胞在B细胞白血病/淋巴瘤治疗方面发展迅速[4]。然而，由于缺乏AML限制性靶标及难以避免的不良反应，CAR-T细胞在髓系肿瘤中的临床应用有限[5]。自然杀伤（natural killer,NK）细胞作为固有免疫关键效应细胞，能迅速杀死肿瘤或感染细胞而无需预先致敏。自体或异体NK细胞输注治疗复发/难治性急性髓系白血病（relapsed refractory AML,R/R AML）已取得可靠疗效[6]。CAR-NK细胞将CAR靶向肿瘤特异性抗原及增强免疫细胞活性优势与NK细胞先天抗肿瘤功能相结合，增强了NK细胞对AML原始细胞的靶向性和裂解活性[3]。目前，针对AML的CAR-NK治疗大多还处于特异性靶标筛选和验证阶段。本文就CAR-NK细胞疗法在AML治疗领域最新研究进展作一综述，为CAR-NK细胞在AML中的基础研究及临床应用提供参考。

一、CAR技术作用原理

CAR是通过基因工程技术构建的能识别抗原并激活效应细胞的功能基因片段，通常由胞外结构域、跨膜区和胞内结构域组成。胞外结构域由负责识别并特异性结合抗原的单克隆抗体单链可变片段及铰链区构成，胞内结构域则由共刺激分子和信号转导结构域构成。第一代CAR使用CD3ζ作为细胞内信号转导结构域，由于缺乏共刺激信号，不能有效维持效应细胞持久扩增，临床疗效有限；第二代和第三代CAR分别采用CD3ζ联合一个或两个共刺激分子；第四代CAR则同时导入细胞因子基因和共刺激配体，有利于提升效应细胞增殖活性和增加体内持久性[7]；引入自杀基因及通用型CAR正在研发中，有望进一步提高抗肿瘤效应并减少毒副反应[8]。上述CAR结构主要基于CAR-T细胞设计，将其直接应用于NK细胞可能不足以激发CAR-NK细胞最大抗肿瘤潜能，近期利用NK细胞特异性共刺激分子（DPA10、DPA12、2B4）设计的CAR-NK细胞显示出更强的靶细胞裂解活性[9]。除CAR-T和CAR-NK细胞外，以CAR为核心的CAR-NKT、CAR-M、CAR-CIK、CAR-CIML NK、CAR-γδT等一系列新型细胞疗法逐步成为肿瘤免疫治疗新趋势[10,11]。

二、CAR-NK细胞疗法的优势

相比于CAR-T疗法，CAR-NK细胞具有独特临床优势[12]。

多种抗肿瘤机制协同增强其细胞毒效应

NK细胞可释放含穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒，导致靶细胞溶解；通过释放肿瘤坏死因子家族成员，上调其表面死亡配体Fas和TRAIL表达，它们与肿瘤细胞死亡受体结合后激活caspase途径，诱导靶细胞凋亡。NK细胞与靶细胞结合后释放干扰素-γ(IFN-γ），作用于巨噬细胞和树突状细胞以激活适应性免疫反应。还可通过CD16介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤肿瘤细胞。CAR修饰的NK细胞将其杀伤能力集中于特定抗原，随着高特异性共刺激分子的研发，CAR-NK细胞显示出更强的细胞毒性。CAR-NK细胞的非CAR依赖性抗肿瘤活性，使其能够有效根除CAR靶标下调或缺失的异质性肿瘤细胞，减少抗原逃逸导致的复发，提高免疫治疗效果[7]。

CAR-NK细胞更具安全性

NK细胞的杀伤作用主要针对感染或其他异常细胞，其抑制性受体KIR和NKG2A可与正常细胞固有MHCⅠ类或Ⅱ类分子结合，识别与保护健康细胞。由于CAR-NK释放的细胞因子谱不同于CAR-T细胞，在之前研究中并没有证据表明CAR-NK细胞可诱发严重细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征以及巨噬细胞激活综合征等。与CAR-T细胞不同，同种异体NK细胞输注在介导移植物抗白血病效应（GVL）的同时并不会诱发移植物抗宿主病（GVHD）。自杀基因的导入，使得体外和体内均能快速消除CAR-NK细胞，不良事件发生时有助于迅速降低毒副作用。NK细胞平均寿命仅为2周左右，进一步保障了CAR-NK细胞产品的安全性[10]。

NK细胞来源丰富，制造成本低

CAR-NK细胞克服了CAR-T细胞自体来源储量低、扩增能力差、制备时间长等不足，NK细胞系、健康供者外周血、脐带血及诱导多能干细胞等来源的NK细胞有望实现同质化大规模临床生产，降低制造成本，成为随时可用于临床的现成产品[13,14]。

三、CAR-NK细胞在AML中的研究现状

理想CAR-NK靶点应高度表达于AML细胞，低表达或不表达于正常造血组织，保证CAR-NK高效靶向肿瘤细胞前提下将脱靶毒性降至最低。目前针对AML CAR-NK的靶点CD33、NKG2D已进入临床试验阶段，其他研究靶点CD123、FLT3、CLL-1、CD38、CD4、CD276、CD7、NPM1等也在临床前研究中显示出有效抗AML活性。

CD33

CD33表达于90%AML细胞表面。体外研究显示，阳性率约86.3%的第二代CD33 CAR-NK92细胞在效靶比为2∶1时对CD33+AML细胞MOLM-13杀伤作用显著高于未经基因修饰的NK92细胞（37.63%±3.34%vs1.60%±0.58%)[15]。然而，首次人体试验并未显示出明显临床疗效，3例R/R-AML患者接受大剂量（5×109) CD33 CAR-NK92细胞输注后均未获血液学缓解。该研究结果可能归因于输注前辐照限制了细胞增殖和杀伤能力[16]。Albinger等[17]通过使用BaEV-LVs转导健康供体外周血NK细胞产生的CD33 CAR-NK细胞与未经转导的NK(untransduced NK,UTD-NK）细胞相比，转导细胞对CD33+AML细胞OCI-AML2杀伤能力显著增强，单剂量（1×107) CD33 CAR-NK细胞输注即可清除80%OCI-AML2移植小鼠骨髓、脾脏及外周血AML细胞，多次输注增强其抗白血病作用的同时并未出现明显不良反应。Soldierer等[18]研究显示CD33和CD123 CAR-NK细胞在效靶比为1∶1时对AML细胞NOMO-1和MOLM-14(CD19-CD33+CD123+）的体外裂解率高达90%；该研究还显示，异种移植小鼠模型中约90%AML-M4细胞和60%AML-M5细胞可被CD33和CD123 CAR-NK细胞有效清除。

CD123

CD123又称白细胞介素-3受体α (interleukin-3receptorα,IL-3Rα），表达于大部分AML原始细胞及白血病干细胞（leukemis stem cells,LSC）表面，其已被证明是免疫治疗药物临床试验的安全靶点。Christodoulou等[19]研究显示，CD123-2B4.ζ CAR-NK细胞与CD123+AML细胞MV-4-11共培养72 h后IFN-γ分泌水平明显升高（65%vs14%），效靶比为1∶1时对MV-4-11具有最大杀伤活性（93.8%±5%），经CD123-2B4.ζ CAR-NK细胞处理后，MV-4-11移植小鼠中位生存时间显著延长（63vs55 d,P<0.05）。Caruso等[20]利用逆转录病毒构建的第二代CD123 CAR-NK细胞在体外对THP-1、OCI-AML3、MOLM-13细胞表现出明显杀伤活性，与原代AML细胞共培养24 h后CD123+白血病残留细胞显著低于对照组（3.6%vs38.1%）。Morgan等[21]研究显示，IL-15 CD123 CAR-NK92细胞在3种效靶比（1∶1、5∶1、10∶1）下同KG-1a细胞共培养48 h后，KG-1a凋亡比率均大于95%;IL-15 CD123 CAR-NK92细胞输注两周后，CD123+AML移植小鼠体内白血病负荷由初始60%下降至20%，而对照组依然保持初始水平。

NKG2D

NKG2D受体能够识别肿瘤抗原并激活免疫细胞启动抗肿瘤免疫反应。其配体常表达于恶性肿瘤细胞表面，或在DNA损伤、机体感染时上调。肿瘤相关过度表达使NKG2D成为抗AML治疗理想靶标。Du等[22]通过非病毒piggBac转座子技术利用人外周血来源NK细胞构建的IL15 NKG2D CAR-NK细胞在效靶比由2.5∶1至20∶1时对NKG2D阳性KG-1、MOLM-14、HCT-116及SKOV3细胞均表现出显著抗肿瘤细胞活性；移植KG-1细胞小鼠经IL15NKG2D CAR-NK细胞处理后中位生存期较PBS组延长27%，且增加治疗剂量并未出现明显不良反应，为期100 d观察中，所有接受3次IL15 NKG2D CAR-NK细胞治疗的小鼠均存活良好。

FLT3

SENTI-202是美国Senti Bio公司利用逻辑门控基因电路技术开发的即用型CAR-NK细胞，靶向FLT3和/或CD33+AML细胞，增加肿瘤清除作用的同时保护健康造血干细胞免受肿瘤外毒性[23]。新型NK细胞系NK101较NK92具有更快的增殖速度和更短的解冻后恢复时间[24]。NK101经多基因修饰产生的NK111对EoL-1、KG-1和Raji等细胞的杀伤作用明显增强（P<0.05)[25]。Hwang等[25]在此基础上构建的FLT3 CAR-NK111细胞与FLT3+白血病细胞EoL-1和REH共培养24 h后肿瘤细胞凋亡率分别高达99.4%和81.2%。

CD38

CD38单克隆抗体达雷妥尤单抗已在AML研究中显示出良好临床前活性[26]。然而，由于CD38同时表达于成熟髓系细胞及其前体细胞，脱靶效应限制了其在AML治疗中的应用。Gurney等[27]使用低表达CD38的NK细胞系KHYG-1构建CD38 CAR-KHYG-1效应细胞对CD38+THP-1裂解作用明显强于模拟转导的KHYG-1细胞（58%vs28%）。将CD38 CAR导入CD38基因敲除（knockout,KO）的原代NK细胞能成功避免效应细胞互相攻击。该研究还显示，全反式维甲酸（all trans retinoic acid,AT-RA）可通过CD38基因第一内含子中的维甲酸反应元件上调所有AML亚型CD38表达，平均上调5倍左右，经ATRA处理的CD38-KG1a细胞可被CD38CAR-NK细胞有效清除。Naeimi Kararoudi等[28]研究显示，ATRA可同时上调肿瘤细胞和NK细胞CD38表达，增加CD38 CAR-NK细胞靶向性的同时抑制NK细胞的直接杀伤作用，故应在过继细胞转移之前使用ATRA，以免降低NK细胞固有抗肿瘤活性。

CLL-1

CLL-1在AML细胞和白血病干细胞上选择性表达[29]。Gurney等[30]通过TcBuster转座子系统构建的CLL-1 CAR-NK细胞有效地靶向CLL-1+AML细胞U937、OCI-AML2、EM2的杀伤作用明显优于UTD-NK细胞（P<0.05）。该研究还显示，利用CRISPR/Cas9技术敲除NK细胞CISH基因可阻断该基因对NK细胞的靶向抑制途径，增强CLL-1CAR-NK细胞的细胞毒作用、细胞因子释放水平和体内持久性。CISH KO CLL-1 CAR-NK细胞在效靶比为1∶1时较UTD-NK细胞和CLL-1 CAR-NK细胞对原代AML细胞显示出更强的细胞毒作用（P<0.05）。

CD4

CD4在AML M4和M5亚型中表达率分别为65%和78.3%，其他亚型中约为30%-40%。CD4 CAR-NK细胞在效靶比为2∶1时与CD4+细胞株THP-1、U937、MOLM-13共培养24 h，肿瘤细胞裂解率分别为89%、98%和77%；当效靶比增加至5∶1，上述3种肿瘤细胞裂解率几乎可达100%，对AML患者骨髓样本中CD4+白血病细胞裂解率同样接近80%-100%。体内试验显示，与对照组相比，CD4 CAR-NK组小鼠d 7肿瘤负荷减少90%,d 9两者差异达98%，显著延长了小鼠存活时间。除此之外，CD4CAR-NK细胞还可通过消耗CD4+Tregs细胞增强NK细胞杀伤活性、促进CD8+效应细胞分化，提高细胞过继免疫治疗疗效[31]。

其他

Ureña-Bailén等[32]研究结果显示，CD276在AML细胞系NOMO-1、THP-1、U-937中高度表达（80%-100%),NK92细胞对AML细胞裂解率仅为16%，而CD276-CAR-NK92的AML细胞裂解率高达95%,CBLB、TIGTI基因敲除后其抗白血病活性可增强2.5-3倍。CD7在约24%AML患者中表达。朱欣颖等[33]研究表明，第三代CD7 CAR-NK-92MI细胞分泌的IFN-γ和颗粒酶B细胞因子水平较NK-92MI明显升高（P<0.05），对CD7+AML细胞杀伤作用显著增强（73.04%±13.40%vs15.88%±12.62%）。以肿瘤相关抗原为靶点的细胞免疫治疗可能由于抗原重叠导致脱靶效应和肿瘤耐药，靶向AML特异性致癌基因在一定程度上可避免损伤正常造血组织，降低骨髓毒性。NPM1突变在AML中检出率为25%-35%，在细胞遗传学正常AML中检出率超过50%。NPM1 CAR CIML NK细胞对NPM1+HLA-A2+AML细胞显示出CAR依赖性靶细胞杀伤作用。经NPM1 CAR CIML NK细胞处理的异种移植小鼠与CIML NK组相比白血病负荷显著降低[34]。

四、存在的问题与挑战

CAR-NK细胞疗法虽在AML临床前研究中取得了初步成效，但其临床应用仍处于起步阶段，面临许多挑战：(1)目前CAR结构大多为CAR-T设计，对NK细胞并非最佳选择。CAR结合位置及其与NK细胞表面距离将影响其识别抗原及激活NK细胞能力，最优化CAR结构还有待探索[9]。(2)慢病毒载体转导效率低，介导的p53激活可导致细胞周期停滞，增殖能力受损，并在细胞培养过程中促进细胞凋亡；逆转录病毒基因转导易引起插入突变，产生致癌风险。非病毒载体转座子系统及电穿孔技术的发展有望提高转导效率的同时增强安全性能[34]。(3)与T细胞和其他人类细胞相比，NK细胞对冷冻过程较敏感，解冻后CAR-NK细胞存活率和细胞毒作用显著降低，需探索最佳冷冻保存策略以使CAR-NK细胞成为现成产品[35]。(4)CAR-NK细胞寿命短、体内持久性有限，需重复给药才能维持其疗效[36]。

五、结语

CAR-NK细胞疗法是一种新兴的、有前景的AML细胞免疫治疗策略。双CAR结构或串联CAR及自杀基因与细胞因子基因的导入有利于增强CAR-NK细胞特异性、体内持久性及靶细胞裂解活性，降低抗原逃逸、脱靶效应等不良反应。目前基于CAR-NK细胞的临床研究主要针对R/R-AML患者，尚未明确哪些患者对CAR-NK细胞治疗反应最好以及何时应用CAR-NK细胞可获得最大临床效益。例如：CAR-NK细胞与化疗联合是否可预防复发？CAR-NK联合免疫检查点抑制剂是否有利于增强体内活性？异基因造血干细胞移植前应用CAR-NK细胞是否有助于提高移植疗效？CAR-NK是否可用于移植后维持治疗以防止复发？综上所述，CAR-NK细胞在AML免疫治疗领域前景广阔，并有可能成为现成产品广泛应用于临床。上述临床前研究已明确CAR-NK细胞在体外和体内同种异体移植模型中的抗AML活性，但缺少临床试验数据支持。正在进行的临床前研究和临床试验将进一步明确其疗效。相信随着研究的不断深入，CAR-NK细胞治疗将在AML基础研究和临床应用方面发挥更大作用，为AML患者提供安全、高效、低成本的治疗选择。

参考文献:

[6]王薇雅,卢绪章,陈涛.自然杀伤细胞治疗急性髓系白血病的研究进展.中国肿瘤临床,2020,47(1):43-46.

[8]朱芳明,蔡晓晴,崔畅,等.通用型嵌合抗原受体T细胞的研究现状及进展.中国新药杂志,2021,30(13):1192-1199.

[15]刘延众,潘丽娟,唐取来,等.靶向CD33的CAR修饰的NK92细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用.中国肿瘤生物治疗杂志,2018,25(5):462-468.

[33]朱欣颖,刘欣,王兴兵,等.靶向CD7的嵌合抗原受体NK-92MI细胞对CD7阳性血液系统恶性肿瘤细胞的杀伤作用.中国实验血液学杂志,2020,28(4):1367-1375.

基金资助:甘肃省药品监督管理局科研项目(2021GSMPA009);兰州市科技局项目(2021-1-110);

文章来源:彭惜茹,成娟.嵌合抗原受体修饰的NK细胞在急性髓系白血病治疗领域的研究进展[J].中国实验血液学杂志,2023,31(06):1905-1909.