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维生素D受体基因与NF-κB通路在白血病患儿血液中的研究

2023-11-21 175 上传者：管理员

摘要：目的：探讨维生素D受体(VDR)基因与NF-κB通路在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达情况、临床意义及对预后的影响。方法：选取2018年12月至2021年12月明确诊断为ALL的30例患儿作为病例组，30名健康体检儿童作为对照组；采集所有研究对象外周血，通过实时荧光定量PCR检测VDR、NF-κB mRNA表达，Western blot检测VDR、NF-κB蛋白表达，并回顾性分析上述基因mRNA表达情况与患者临床特征间的关系。结果：ALL患儿外周血中VDR mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05)，而NF-κB mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.001)。初诊时外周血白细胞数<50×109/L的患儿NF-κB mRNA的表达明显高于≥50×109/L的患儿(P<0.01)；感染患儿NF-κB mRNA的表达水平明显高于非感染患儿(P<0.05)；不同性别、年龄、初诊时血红蛋白量、血小板数、免疫学分型、危险度与诱导缓解情况的患儿NF-κB mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：NF-κB表达情况对儿童ALL诊断及预后判断具有较高的价值。

关键词：
NF-κB通路
儿童
急性淋巴细胞白血病
维生素D受体
预后
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急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，它是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性克隆性疾病。采用联合化疗、免疫治疗、基因靶向治疗及骨髓移植等治疗手段可以提高儿童ALL的治疗效果，但耐药肿瘤细胞的持续存在导致部分患儿在强烈化疗后出现临床复发，这是全世界每年数百万肿瘤患儿死亡的主要原因[1]。维生素D是一种类固醇激素，通过维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）介导发挥多种激素样的生物活性，体外研究发现维生素D缺乏或VDR功能障碍将增加肿瘤、炎症性疾病及免疫相关性疾病的风险[2]。核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB）是一种多功能转录因子，其活化与ALL的发生、发展、预后及化疗耐受有关[3]，在没有刺激的细胞中，大部分NF-κB二聚体通过与细胞质中抑制因子结合而以无活性的状态存在，IκB-β就是其中一种抑制子。VDR是NF-κB信号通路活性调控中的重要上游分子，国外研究发现维生素D可通过激活VDR继而抑制NF-κB的激活，预防肿瘤的发生[4]。本研究旨在探讨VDR与NF-κB在ALL患儿中的表达及意义，探讨其与疾病临床特征的相关性，为寻找新的儿童白血病临床预后分析和随访靶标奠定基础。

一、资料与方法

研究对象及分组

选取2018年12月至2021年12月在新疆医科大学第一附属医院儿内一科经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学（MICM）分型标准确诊的ALL患儿30例作为病例组，其中男15例，女15例，中位年龄6.7岁。对照组为同期健康体检儿童30例，其中男15例，女15例，中位年龄5.5岁。本研究已获得患儿及家属知情同意。纳入标准：所有ALL患儿的诊断及分型均符合《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》[5]；年龄为0-14岁；获得监护人知情同意。排除标准：伴有在急性期未能控制的疾病；伴有依赖性输血、严重感染；关键性研究资料缺失；未获得监护人知情同意的患儿。

试剂与仪器

北京索来宝生物科技有限公司提供红细胞裂解液、RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒；RNA提取试剂盒为康为世纪生物科技公司产品；逆转录试剂盒及定量PCR试剂盒由北京全式金生物技术公司提供；目的基因及内参照GAPDH引物均来自上海生工生物工程有限公司；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒由北京博泰斯生物技术有限公司提供；VDR、NF-κB、IκB-β、β-actin抗体和山羊抗兔Ig G(H+L）为美国Proteintech公司产品。荧光定量PCR仪由美国Thermo Fisher公司产品，电泳仪由美国Bio-Rad公司产品。

实时荧光定量PCR检测VDR、NF-κB m RNA表达

采集病例组与对照组儿童清晨空腹外周血3 ml，以EDTA抗凝试管收集，利用红细胞裂解液提取出白细胞，用RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，用紫外分光光度计进行检测，各组吸光值（A）比值A260/280均>1.8。再使用逆转录试剂盒对RNA进行逆转录获得c DNA备用，随后以c DNA为模板利用RT-PCR试剂盒和荧光定量PCR仪进行PCR扩增，定量检测VDR、NF-κB m RNA的表达情况。VDR上游引物：5′-TATGACCTGTGAAGGCTGCA-3′，下游引物：5′-ATCATCTCCCGCTTCCTCTG-3′；NF-κB上游引物：5′-AATGGTGGAGTCTGGGAAGG-3′，下游引物：5′-TCTGACGTTTCCTCTGCACT-3′；内参GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反应体系：2×Perfect Start Green q PCR Super Mix 10μl；上下游引物各0.4μl;c DNA Template 2μl;dd H2O 6.8μl。反应条件：94℃预变性30 s,94℃变性5 s,55℃退火延伸30 s,32个循环。实验均设置3次重复，数据处理采用2-ΔΔct公式计算。

Western blot检测VDR、NF-κB、IκB-β蛋白

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白质分析试剂盒进行定量，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后转移至PVDF膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1.5 h,TBST缓冲液洗涤3次后加入1∶2 000的VDR抗体、1∶1 000的NF-κB抗体、1∶500的IκB-β抗体，4℃冰箱孵育过夜。加入二抗室温避光孵育50 min,TBST缓冲液洗膜3次后滴加ECL化学发光底物，暗室曝光并进行灰度值扫描后，用软件进行灰度值分析，计算VDR蛋白、NF-κB蛋白、IκB-β蛋白与β-actin的灰度比值。

统计学分析

使用统计软件SPSS 26.0及Graph Pad Prism 8.0.2软件对实验结果进行统计分析及绘图。计量资料以均数±标准差（±SD）表示，比较采用两独立样本t检验分析两组之间的显著性差异，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

两组儿童外周血VDR、NF-κB m RNA表达水平比较

与对照组儿童相比，病例组患儿VDR m RNA相对表达水平为0.61±0.89，显著降低（P<0.05），而NF-κB m RNA相对表达水平为5.03±5.84，显著升高（P<0.001）（图1）。

ALL患儿血液VDR、NF-κB m RNA表达水平与其临床特征的关系

不同性别、年龄、初诊时白细胞数、血红蛋白量、血小板计数、免疫学分型、危险度、感染情况及诱导缓解情况的患儿外周血VDR m RNA的相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。初诊时外周血白细胞数<50×109/L的患儿NF-κB m RNA的表达水平高于≥50×109/L的患儿，比较差异有统计学意义（P<0.01）；感染患儿NF-κB m RNA的表达水平高于非感染患儿，比较差异有统计学意义（P<0.05）；不同性别、年龄、初诊时血红蛋白量、血小板数、免疫学分型、危险度及诱导缓解情况的患儿NF-κB m RNA的表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

两组儿童外周血VDR、NF-κB、IκB-β蛋白表达水平的比较

Western blot结果显示，与对照组比较，ALL组VDR蛋白的相对表达量减少（P<0.05),NF-κB蛋白相对表达量显著增多（P<0.01),IκB-β蛋白相对表达量显著减少（P<0.01）（图2-3）。

三、讨论

VDR作为介导维生素D发挥生物学效应的受体，在人体正常组织细胞和肿瘤细胞中均表达，常见于肠、肾、骨、卵巢、乳腺和前列腺等[6]。NF-κB是一类能与多种基因启动子及增强子部位的κB发生特异性结合并促进其转录的蛋白质，与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡、耐药、侵袭和转移有密切关系[7]。在造血系统肿瘤中，NF-κB的持续活化有利于恶性增殖细胞的存活和维持，并可通过调节耐药相关靶基因，降低肿瘤细胞对药物的反应敏感性[3]。研究发现，VDR信号的激活可明显抑制恶性肿瘤细胞增殖，促进细胞分化正常化，而这一机制可能与调控经典炎症通路NF-κB有关。迄今已发现在胚胎成纤维细胞等多种细胞中，维生素D正是借由与VDR的受体配体效应来调节NF-κB信号通路[8]。基础研究发现，VDR不仅能直接上调NF-κB抑制蛋白IκB的表达并增强其稳定性，而且还与NF-κB的亚单位P65存在生理性结合，通过直接阻碍P65的核易位及其与DNA的结合活性等方式来直接抑制NF-κB P65的活性[9]。因此，VDR可能是通过干预NF-κB通路抑制下游炎症反应，而这一机制在乳腺癌、颈部鳞状细胞癌等疾病中已有相关论述[10]，但在儿童ALL的研究中较少涉及。Chandra等[11]在银屑病研究中发现，VDR表达与银屑病严重程度及病程呈显著负相关。Gascoyne等[12]研究发现，VDR在一些淋巴样癌中高表达。另外，Zhumina等[13]研究表明，VDR在ALL患者和健康人之间没有显著差异，且VDR表达与血浆25(OH)D水平之间缺乏相关性。本课题组前期研究发现，维生素D能抑制人T细胞白血病细胞增殖，诱导其凋亡，上调VDR蛋白表达[14]。

本研究通过实时荧光定量PCR和Western blot检测了VDR、NF-κB在ALL患儿与健康体检儿童中的表达情况，结果显示，与健康体检儿童相比，ALL患儿血液中VDR为低表达，NF-κB为高表达。不同初诊时外周血白细胞数与感染情况的患儿NF-κB m RNA的表达水平差异有统计学意义，提示NF-κB可能在儿童ALL的发生、发展及预后中发挥重要作用，且有望成为儿童ALL诊断的分子标志物及临床治疗、预后评估的有效指标之一，这可能与VDR信号激活后通过上调IκB-β来抑制NF-κB通路有关。目前，VDR在儿童恶性血液病中的表达及对预后的影响尚存在争议，相关报道较少，因此，需要更多的研究来确定VDR水平与白血病发展和疾病预后风险之间的可能联系。

参考文献:

[5]中华医学会儿科学分会血液学组,《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议.中华儿科杂志,2014,52(9):641-644.

[6]邱戌旦,朱益民.维生素D及其受体基因多态性与疾病的关系研究进展.医学综述,2015,21(14):2528-2530.

[7]于锦超,于敏,莫炜.NF-κB信号通路在肿瘤发生和炎症反应中的作用.药物生物技术,2016,23(1):82-85.

[14]古丽巴哈·买买提,刘玉,赵莉,等.1,25(OH)2D3对人白血病6T-CEM细胞株凋亡及VDR蛋白表达的影响.中国医药导报,2017,14(18):12-15.

基金资助:新疆维吾尔自治区天山创新团队计划项目(2020D14027);新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2021D01C323);

文章来源:伊丽苏娅·帕尔哈提,海力其古丽·努日丁,严媚.维生素D受体基因与NF-κB通路在急性淋巴细胞白血病患儿血液中的表达及意义[J].中国实验血液学杂志,2023,31(06):1624-1628.