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槲皮素对白血病细胞增殖、凋亡的影响

2024-02-19 208 上传者：管理员

摘要：目的探讨槲皮素对白血病细胞增殖、凋亡的影响。方法人原髓细胞白血病细胞(HL-60)加入10、20、40μmol/L浓度的槲皮素100μl,分别记为槲皮素10、20、40μmol/L组，另加入RPMI1640培养液100μl为空白组。比较各组细胞增殖、凋亡、黏附能力、迁移能力、侵袭情况；检测各组HL-60细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)家族蛋白8、9、3的表达情况。结果槲皮素抑制白血病细胞的增殖活力，其活力随槲皮素浓度和作用时间的增加而加强。槲皮素各组凋亡指数较空白组增加，黏附率、迁移率、侵袭数较空白组降低，差异有统计学意义(P<0.05),且槲皮素各组呈显著浓度依赖性(P<0.05)。40μmol/L槲皮素能够显著上调caspase9、3蛋白表达(P<0.05)。结论槲皮素能够抑制白血病HL-60细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，对其具有较强的杀伤作用，凋亡机制与细胞中caspase9、3蛋白有关。

关键词：
凋亡
增殖
杀伤
槲皮素
白血病细胞
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白血病是因造血干细胞出现特异变化的克隆性恶性疾病[1,2],该病患者伴有贫血、淋巴肿大等症状[3,4]。今年来，白血病在我国的发病率和病死率逐渐攀升，位于世界中等水平[5,6]。目前，白血病的治疗手段已化疗为主，并没有明确的特效药。但化疗药物毒副作用大，所以寻找效果良好且毒副作用小的药物刻不容缓。有研究表明，许多中药提取物对白血病细胞有杀伤作用，如雷公藤甲素、人参多糖等[7,8],这类中药提取物还具有对人体毒副作用小，成本低，治疗效果好的优点。槲皮素是天然化合物，属于黄酮类，在花、叶和果子中可以提取，也在部分中药中可以提取，对炎症反应、过敏反应，病毒、细菌、癌细胞等具有较好的治疗作用，近些年来，关于其对肿瘤的抑制、抵抗作用也被广泛研究报道[9,10,11,12,13]。本研究旨在体外培养白血病细胞，探讨槲皮素对白血病细胞的增殖、凋亡及杀伤效果，同时对可能存在的作用机制进行分析。

1、材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器

人原髓细胞白血病细胞(HL-60,货号：CL-0110,公司：普诺赛);槲皮素(货号：Q4951,公司：Sigma);二甲基亚砜(DMSO,货号0219605580,公司：MP Biomedicals);RPMI1640培养基(货号PM150110P,公司：普诺赛);胎牛血清(货号：164210,公司：普诺赛);CCK-8(货号P-CA-001,公司：普诺赛);TUNEL(货号：P-CA-007,公司：普诺赛);Hoechst33342染色液购自北京萌壮科技有限公司；TDL-80-2B低俗台式离心机；瑞沃德CO2培养箱：赛默飞的酶标仪和蛋白成像系统；Leica徕卡荧光显微镜；默克光度计和电泳仪；转膜仪购自的山海艾研生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

HL-60转移至培养基中，37 ℃、5%CO2培养，每2～3 d传代换液，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 槲皮素配制

槲皮素溶解于DMSO配成40 μmol/L储备液，-20 ℃冰箱保存，以RPMI1640培养液稀释到10、20、40 μmol/L。

1.4 CCK-8法检测HL-60增殖活力

调整HL-60密度2×105个/ml, 接种于96孔板。加入不同浓度的槲皮素100 μl[14](10、20、40 μmol/L),分别记为槲皮素10、20、40 μmol/L组，另加入RPMI1640培养液100 μl为空白组。分别等待24、48、72 h, 加入10 μl CCK-8,静置3 h。计算增殖率。不同浓度设6个对照，取平均值，下同。

1.5 TUNEL法检测HL-60凋亡情况

蓝色荧光为细胞核未凋亡，绿色荧光为细胞核凋亡或破碎。荧光显微镜下选10个视野进行镜下观察，计算凋亡率。凋亡率 =(视野内凋亡HL-60细胞数/视野内HL-60总数)×100%。

1.6 细胞黏附实验检测HL-60黏附力

细胞分组、处理、加药同上。在24孔板接种。磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，0.1%结晶紫染色，0.2% Triton X-100固定，紫外分光光度计在550 nm处检测各孔 A,计算黏附率。黏附率= A给药组/A空白组×100%。

1.7 划痕修复实验检测HL-60迁移能力

调整HL-60密度2×105个/ml, 接种于96孔板。细胞单层生长铺满时，无菌移液枪头均匀划线，PBS冲洗划落细胞。37 ℃、5% CO2 及饱和湿度培养48 h, 测量划痕处细胞迁移面积，计算迁移率。迁移率=给药组迁移面积/空白组迁移面积×100%。

1.8 transwell法检测HL-60侵袭能力

基质胶4 ℃静置一夜，直至融化，培养基稀释(1∶3),取40 μl均匀铺于下室，37 ℃孵育1 h, 待其胶凝，待用。37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养48 h, 分别取200 μl接种于transwell小室上室，并在transwell小室下室加入含有20%胎牛血清的RPMI1640 培养液600 μl。 37 ℃、5% CO2及饱和湿度等待24 h后，去掉未穿膜细胞，收集迁移至滤膜下层的细胞，甲醇固定，染色。计算侵袭数。

1.9 Western印迹检测

caspase8、9、3 蛋白表达调整HL-60密度2×105个/ml, 接种于96孔板，加入40 μmol/L槲皮素分别培养24与48 h, 记为槲皮素40 μmol/L 24、48 h组，另加入RPMI1640培养液100 μl为空白组。提取总蛋白，测定浓度。配制聚丙烯酰胺凝，添加电泳液。浓缩：采用100 V恒压电泳约20 min; 分离：采用恒压120 V电泳约60 min。转膜25 min, 封闭液封闭2 h, 分别加3 μl的caspase8、9、3一抗4 ℃过夜，洗脱一抗20 min, 每10 min一次换液，然后用1.5 μl 二抗37 ℃摇床孵育1 h, 洗脱二抗1 h, 显影，扫膜仪成像。

1.10 统计学分析

采用SPSS23.0软件进行t或F检验。

2、结果

2.1 TUNEL法检测HL-60凋亡情况

与空白组相比，槲皮素各组HL-60凋亡指数显著增加，且随槲皮素浓度增加呈显著剂量依赖性(P<0.05),见图1、表1。

图1 各组HL-60凋亡、迁移、侵袭

2.2 划痕修复实验检测HL-60迁移能力

与空白组相比，槲皮素组HL-60迁移率显著降低，随槲皮素浓度增加，迁移率呈显著剂量依赖性(P<0.05),见图1、表1。

2.3 transwell法检测HL-60侵袭能力

与空白组相比，槲皮素组HL-60侵袭数降低，且槲皮素浓度越高，细胞侵袭数越少，见图1、表1。

2.4 CCK-8法检测HL-60增殖活力

与空白组相比，槲皮素各浓度组细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05),且抑制率随时间和浓度的增加而显著加强(P<0.05)。72 h抑制率虽高但过度抑制，后续实验均以48 h为作用时间，见表1。

2.5 细胞黏附实验检测HL-60黏附力

与空白组相比，槲皮素各组HL-60黏附率显著降低，且随槲皮素浓度增加，黏附率呈显著剂量依赖性降低(P<0.05),见表1。

表1 HL-60增殖活力、凋亡情况、黏附力、迁移能力、侵袭能力比较

2.6 Western印迹检测caspase8、9、3蛋白表达

槲皮素40 μmol/L 24 h组、槲皮素40 μmol/L 48 h组caspase9、3蛋白的表达量较空白组显著升高(P<0.05)。槲皮素40 μmol/L 48 h组caspase9、3表达量比槲皮素40 μmol/L 24 h组显著增高(P<0.05)。3组caspase8差异无统计学意义(P>0.05),见表2、图2。

表2 各组caspase8、9、3蛋白表达比较

图2 各组caspase8、9、3蛋白表达

3、讨论

本实验表明，槲皮素对白血病细胞的生长具有一定的抑制作用，可将其投入临床，应用于白血病患者的医治。白血病的发生发展与恶性克隆的造血功能细胞的生长发育、侵袭、转移等相关，这个特点使的绝大多数白血病患者难以治愈[15]。所以，降低白血病细胞的迁移和侵袭是治疗的一个思路，但白血病细胞的迁移和侵袭非常复杂[16]。白血病是非实体瘤，所以白血病细胞的迁移和侵袭与常规的实体瘤略有不同，但大致过程例如细胞黏着、基质合成与降解等是相似的。本研究表明，槲皮素能够抑制白血病细胞的黏附率、迁移率和侵袭率，并且随着槲皮素浓度的增加，抑制作用增强，这意味着槲皮素可以抑制白血病细胞的迁移和侵袭能力。

caspase与细胞的凋亡密切相关，它是一种蛋白激酶，具有相似的氨基酸序列、结构和特异性[17]。caspase活化后会引起细胞凋亡，这与其对细胞结构酶解、灭活阻止细胞凋亡有关的细胞内物质相关[18]。caspase8、9是调控caspase, 与打靶和激活调控相关，其中caspase8还能够传递凋亡信号；caspase3是效应caspase, 是参与凋亡的效应物[19,20]。本研究表明，槲皮素作用后caspase9、3蛋白的表达量显著变化，出现上调，并且随槲皮素作用时间增加，上调越明显，所以由此猜测，槲皮素诱导的是内源性通路介导的凋亡。

综上，槲皮素能够抑制白血病细胞增殖，诱导其凋亡，并且对白血病具有较强的杀伤作用，这与内源性通路中caspase9和3蛋白介导的凋亡密切相关，本文为槲皮素在临床上应用于白血病的治疗提供了实验依据，其具体的通路机制还需进一步研究。

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