作为一种独特地理分布特征的恶性肿瘤,鼻咽癌(NPC)在全球癌症统计中呈现显著特点｡统计数据显示,该病新发病例达120416例,在所有癌症中排名第23位,死亡病例73476例,位居癌症致死原因第21位｡值得注意的是,亚洲地区的发病数(100298例)和死亡数(61442例)分别占据全球总数的83.3%和83.6%[1]｡NPC好发于鼻咽部位,其发病机制涉及遗传因素､病毒感染及环境影响等多个方面,在我国头颈部恶性肿瘤中发病率和转移率均居高位[2]｡目前,虽然放疗联合化疗是主要治疗手段,但约70%患者就诊时已进展至晚期,常伴有远处转移和复发情况[3]｡此外,这些治疗方式往往会引起口腔黏膜放射性损伤､胃肠道不适和骨髓功能抑制等不良反应[4]｡探索安全有效的治疗方案成为当前亟待解决的重要课题｡传统中医药在抗癌领域积累了丰富经验｡按照中医理论[5],肿瘤疾病与“岩”“癥瘕”“痈疽”等病症相通,其本质与热毒积聚密切相关｡在肿瘤防治中,清热解毒类药物占据重要地位[6],诸如西黄丸､片仔癀､蒲公英､半枝莲等中药,均能通过多重途径实现抑制增殖､防止突变和调节免疫等抗癌效果[7-9]｡研究证实,中医药不仅能增强疗效､降低毒性,还可减少手术后复发､提升生活品质并延长存活时间[10],中西医结合治疗更能弥补单纯化疗的不足,显著提高治疗效果[11-12]｡山豆根被誉为广西道地药材,传统上用于清热解毒和抗肿瘤｡当代药理研究证实,其抗肿瘤效果显著,所含成分能够通过多个靶点和途径抑制肿瘤细胞生长､分化和迁移,并促进其凋亡｡其中生物碱､黄酮､苯并呋喃､三萜及多糖类等成分被确认为关键的抗肿瘤物质[13-15]｡作为我国常用抗癌中药,山豆根及其复方在多种癌症的治疗中展现出良好效果[16]｡本研究运用网络药理学结合分子对接方法,旨在阐明山豆根抗NPC的有效成分及其作用机制,为深入理解其药理活性提供科学依据,同时为进一步研究奠定基础｡

1、资料与方法

1.1山豆根有效成分及靶点查询:采用“山豆根”作为检索词,在TCMSP平台中搜寻其所含化合物｡依据口服生物利用度(OB值≥30%)和类药性(DL值≥0.18)这两项指标进行筛选,并收集相对应的作用靶点｡继而利用UniProt平台对所获得的靶蛋白实施基因命名的标准化处理｡

1.2NPC相关靶点预测:以“NasopharyngealCarcinoma”为检索条件,分别在OMIM､GeneCards和TTD这三个数据库中检索相关疾病靶点｡通过jvenn在线工具对所得结果进行数据整合､去重和可视化分析,并与药物靶点比对,筛选出共同靶点｡

1.3“药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析:使用Perl脚本处理疾病与靶点的关联数据｡首先,提取疾病信息,并读取药物与靶点的关联数据｡所有处理均在Perl环境中完成,确保数据处理的准确性｡通过Cytoscape软件(3.8.0版本)绘制药物-活性成分-作用靶点-疾病的关联网络,以直观展现其相互作用关系｡

1.4构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及核心靶点筛选:选取共同靶点,将其输入STRING在线平台｡在参数设定中,将物种类型限定为“Homosapiens”(人类),并将互作关系的最低限值设为0.4,以此获取PPI网络信息,随后通过Cytoscape软件对所得数据进行可视化处理｡通过CytoNCA(MCODE)插件打分｡在首次筛选中,根据每个评分条件的中位值进行基因标记,筛选出符合条件的基因｡第二轮筛选后最终得到核心靶点｡所有数据处理通过R语言完成,筛选结果通过Cytoscape进行美化和可视化｡

1.5GO功能与KEGG通路富集分析:借助R统计软件的Bioconductor平台,运用ClusterProfiler程序包对山豆根活性组分与鼻咽癌的共同靶点实施GO功能富集与KEGG信号通路分析｡筛选标准为P值<0.05,结果通过条形图展示｡GO功能分析由clusterProfiler､org.Hs.eg.db和enrichplot等R包完成,筛选出显著富集的GO,并生成富集结果表(GO.txt)和相关的柱状图与气泡图｡KEGG通路分析同样通过R包实现,筛选结果,并生成相应的柱状图与气泡图｡

1.6分子对接:首先,自PubChem平台获取重要化合物(配体)的三维结构(SDF格式),继而利用OpenBabel工具将其转化为PDB格式｡核心靶点(受体)的空间构象则从RCSBPDB数据库获取｡在进行对接操作前,需对配体和受体实施能量最小化优化｡应用AutodockTools1.5.6软件对受体进行预处理,包括去除水分子､加入极性氢原子及赋予电荷｡随后使用AutodockVina执行分子对接计算,并通过PyMOL插件确定活性结合位点｡对接结果评估标准如下:当体系结合能低于0kcal/mol时,表明配体与受体能够自发性结合;若结合能值小于-5kcal/mol,则说明二者具有良好的结合活性｡需要注意的是,结合能的负值越大,代表结合作用越稳定｡

2、结果

2.1山豆根的活性成分与靶点:通过TCMSP数据库检索山豆根的活性成分,去除重复和无靶标的化合物后,确定了12种活性成分,并找到了175个相关的靶点｡

2.2NPC靶点获取结果:采用“NasopharyngealCarcinoma”作为检索词,分别在OMIM､GeneCards(设定评分阈值≥10)及TTD三个数据库中搜寻疾病相关靶点｡经数据整合与重复值剔除,共获得2852个NPC相关靶点｡通过jvenn在线平台对比分析药物靶点与疾病靶点,筛选出114个共同靶点｡

2.3“药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析结果:利用Cytoscape3.10.2软件构建了山豆根-活性成分-靶点-鼻咽癌的互作网络图｡在该网络中,药物(山豆根)以左侧绿色节点表示,12个活性成分(包含1个类似结构),114个共同靶点,疾病NPC｡

2.4PPI网络及其核心靶点的筛选:将筛选获得的114个交集靶点输入STRING数据库进行分析,构建了PPI网络｡该网络由114个节点(代表靶点蛋白)和392条连接边(表示蛋白质间的相互作用关系)构成｡运算后获得以下阈值:中介中心性12.34414666,紧密中心性0.555555556,Degree8,特征向量中心性0.161651284,局部聚类系数4.285714286,Network5.666666667｡应用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化处理｡在网络图中,节点表示靶点蛋白,其大小和颜色深浅反映了靶点的重要程度———节点越大､颜色越深,代表该靶点在网络中的作用越显著｡继而运用CytoNCA插件,通过三轮筛选确定了山豆根治疗NPC的关键靶点｡筛选后得到一个包含7个节点和13条边的网络图｡显示核心靶点共7个,分别为HSP90AA1､ESR1､TNF､RELA､BCL2､TP53､AKT1｡

2.5GO功能富集结果分析:对114个交集靶点进行GO功能富集分析,获得2357条显著条目(q<0.05)｡在生物过程(BP)方面,共2177条,涵盖细胞对脂多糖､细菌分子､氧化应激､活性氧､化学应激､营养变化､辐射､凋亡信号通路及异种生物刺激的响应,反映了免疫激活､氧化防御及细胞功能稳定机制｡细胞组分(CC)有57条,主要涉及膜结构(如膜筏､膜微区)､囊泡腔､分泌颗粒腔及各类蛋白激酶复合物,显示了信号传导､转录调控和细胞周期节中的关键作用｡分子功能(MF)包含123条,涉及DNA结合转录因子､RNA聚合酶Ⅱ特异性结合､转录共调节因子､细胞因子受体结合及蛋白酶､磷酸酶等结合功能,主要参与基因表达调控､蛋白降解､信号传导及细胞间通讯｡图1展示了各类别中显著性排名前10的条目｡

2.6KEGG通路富集结果分析:KEGG分析结果显示,114个交集基因富集到169条通路(p值和q值均小于0.05)｡这些潜在靶点集中在几个关键领域｡首先,癌症相关通路如PI3K-Akt信号通路､p53信号通路和TNF信号通路,揭示了这些基因在肿瘤的发生､进展和治疗耐药性中的重要作用｡其次,免疫和炎性反应相关通路如白细胞介素(IL)-17和C型凝集素受体信号通路,表明这些靶点在免疫反应及炎性反应性疾病中的潜在价值｡此外,代谢和血管相关通路如脂质代谢及动脉粥样硬化通路,提示这些靶点与心血管疾病和代谢紊乱密切相关｡最后,病毒感染相关通路(如Epstein-Barr病毒和人巨细胞病毒感染)显示这些基因在病毒相关性癌症和免疫抑制疾病中的治疗潜力｡这些靶点的集中分布表明它们在癌症､免疫调节､代谢性疾病及病毒感染中的关键作用｡基于富集分析所得q值的大小进行升序排列,选取排名前30位的信号通路,并将其可视化为条形图(见图2)｡

图1GO功能富集分析结果

图2KEGG通路分析

2.7分子对接结果:选取山豆根中的11个主要有效成分,包括芒柄花素､无刺甾醇､异鼠李素､山奈酚､毛蕊异黄酮､氧罂粟碱､槲皮素､苦参碱､苦参酮､毛蕊异黄酮和苦参碱,与7个关键靶点HSP90AA1､ESR1､TNF､RELA､BCL2､TP53､AKT1进行分子对接分析｡结果显示,所有对接构象的结合能均低于-5kCal/mol,表明山豆根的活性成分能够与这些靶点形成稳定的结合构象(图3)｡

图3分子对接最低结合能热图

其中,AKT1与毛蕊异黄酮,BCL2与无刺甾醇,ESR1与无刺甾醇,HSP90AA1与毛蕊异黄酮,RELA与无刺甾醇,肿瘤坏死因子(TNF)与无刺甾醇,TP53与无刺甾醇具有较低的结合能和稳定的结合构象｡通过PyMOL软件进行构象分析发现:毛蕊异黄酮在AKT1活性口袋中与ILE-290､THR-211和ASN-53等氨基酸残基形成氢键相互作用(图4-A);无刺甾醇则与BCL2蛋白的ARG-143和ALA-146残基建立氢键连接(图4-B);ESR1与无刺甾醇在LYS-294､TYR-335､HIS-297附近生成氢键(见图4-C);HSP90AA1与毛蕊异黄酮在PHE-138､GLY-97附近生成氢键(见图4-D);RELA与无刺甾醇在ILE-128､GLU-182附近生成氢键(见图4-E);TNF与无刺甾醇在ASN-92附近生成氢键(见图4-F);TP53与无刺甾醇在LYS-294､HIS-297附近生成氢键(见图4-G)｡

图4活性成分与靶点对接图

3、讨论

通过整合网络药理学和分子对接分析,本研究系统揭示了山豆根对NPC的作用机制,得到了一系列关键研究结果｡首先,通过网络药理学方法,筛选出山豆根的多种活性成分,并发现其可能通过多靶点､多通路的协同作用对NPC产生抑制作用｡通过分子对接验证,这些活性成分与NPC的核心靶点(如HSP90AA1､ESR1､TNF､RELA､BCL2､TP53､AKT1等)具有较强的结合能力,表明山豆根中的关键成分具有良好的抗肿瘤潜力｡依据中医学理论,NPC属“鼻渊”“鼻疽”“失荣”等范畴,其核心病机为正气亏虚,兼见毒热内蕴､痰瘀互结等病理变化,临床上应注重清热解毒的治疗原则[17]｡山豆根作为清热解毒的常用中药,其抗NPC的疗效与中医理论中的病机具有高度一致性｡本研究通过网络药理学验证了山豆根中多种活性成分可能通过多靶点､多通路协同作用,调控肿瘤的关键生物学过程｡这与中医强调通过清热解毒､化痰祛瘀来调节NPC病理机制的理论高度契合,进一步支持了山豆根在NPC治疗中的应用｡

山豆根的多种活性成分,如芒柄花素､无刺甾醇､异鼠李素等,均表现出对多种与NPC相关靶点的结合活性｡尤其是AKT1､BCL2和TP53等靶点在肿瘤发生､发展和治疗耐药中发挥了关键作用[18-19]｡这表明山豆根不仅可以通过调控肿瘤细胞的增殖与凋亡来发挥抗肿瘤效应,还可能影响肿瘤的多种信号通路｡与现有文献一致,AKT1通路在多种肿瘤中被认为是促进肿瘤存活和耐药的关键信号通路,山豆根活性成分通过抑制AKT1可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一[20]｡

通过PPI网络和富集分析,本研究进一步揭示了山豆根抗NPC的潜在分子机制｡KEGG通路分析显示,山豆根活性成分主要涉及PI3K-Akt信号通路､p53信号通路及TNF信号通路等｡这些信号通路在NPC的病理进程中发挥着关键作用｡特别是PI3K-Akt信号通路的过度激活,已被证实是促进NPC细胞存活､增殖并抑制其凋亡的重要分子机制[20-21]｡p53通路是调控肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞的重要通路,山豆根可能通过调控p53的活性增强其抗癌效应[22]｡

本研究表明,山豆根通过多条信号通路的协同作用发挥其抗肿瘤潜力｡GO功能富集分析显示,山豆根活性成分不仅影响细胞应激反应和凋亡信号通路,还可能参与免疫调节过程,如细胞因子介导的免疫应答和炎性反应｡这与现有研究一致,越来越多的证据表明,植物药物通过调节肿瘤微环境中的免疫反应来增强抗肿瘤疗效[11]｡此外,山豆根通过抑制氧化应激反应,可能有助于降低NPC细胞的侵袭性｡

尽管本研究为山豆根抗NPC的机制提供了新的见解,但仍存在一些局限性｡首先,网络药理学和分子对接分析的结果需要进一步通过体内和体外实验验证｡此外,山豆根的多成分､多靶点特性增加了研究的复杂性,未来需要通过实验细化其具体作用机制和靶点选择性｡

总之,本研究通过网络药理学和分子对接技术,揭示了山豆根抗NPC的潜在机制,为其作为一种新型抗癌药物提供了理论基础｡未来的研究应进一步深入探索其抗肿瘤活性成分的具体作用机制,并评估其在临床中的应用前景｡

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基金资助:吉林省科技厅社会发展项目[项目编号:20210203186SF];

文章来源:朱源玉,杨坤鹏,林华杰,等.基于网络药理学和分子对接技术探讨山豆根抗鼻咽癌作用机制研究[J].吉林医学,2025,46(05):1034-1039.