鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是具有独特生物学特性的恶性肿瘤，多发于中国南方地区，具有明显的地区聚集性、种族易感性、家族高发倾向。标准治疗后出现的局部复发或远处转移是导致NPC患者预后不佳的重要原因[1],深入探讨NPC发生发展的分子机制对发现新的治疗靶点和改善预后具有重要意义。20世纪70年代，KONOPKA和BENTER在黑腹果蝇中发现第一个生物钟基因，并命名为Period(Per),同源性分析发现三种同源物分别为Per1、Per2和Per3,Per1基因最为重要，是哺乳动物生命活动中的分子中心和外周节律振荡器的重要元件，主要功能包括调节机体的昼夜节律、调节细胞周期和促进DNA损伤修复等，并与肿瘤的发生、发展密切相关[2,3]。本课题组前期研究发现生物钟基因Per1在NPC细胞中呈现低表达[4],且目前有多项研究表明在口腔鳞癌[2]、宫颈癌、乳腺癌、胃癌[5]等恶性肿瘤中亦呈现低表达并与肿瘤进展有关[4]。JAK2-STAT3信号通路参与细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移及免疫调节等重要生命活动，当其异常表达时可促进鼻咽癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤发生，多项研究提示JAK2-STAT3信号通路与鼻咽癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌及多种血液系统恶性肿瘤的进展有关[6]。故本研究将探讨Per1基因影响NPC细胞CNE2侵袭迁移的机制及与上皮-间质转化、JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的关系。

1、材料与方法

1.1材料

人永生化鼻咽上皮细胞NP69(中杉金桥公司),鼻咽癌细胞株CNE2(中山大学肿瘤防治中心),RPMI-1640液体培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)、兔抗人GAPDH、兔抗人Per1、兔抗人JAK2、兔抗人STAT3 (武汉三鹰生物技术有限公司)、兔抗人p-JAK2、兔抗人p-STAT3、兔抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、兔抗人Vimentin(美国CST公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

细胞用含10%胎牛血清及RPMI-1640培养基于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于传代及冻存。

1.2.2 Western blot

将待测细胞加入适量裂解液冰上裂解，用BCA蛋白定量试剂盒定量，等量蛋白上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%～10%),常规湿转法进行转膜，10%脱脂牛奶室温封闭1.5 h, 4℃一抗孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，二抗置于摇床孵育室温2 h,滴入ECL化学发光试剂，AmershamImager 600仪器曝光。应用Image J软件测量各条带的灰度值，以GAPDH为内参，用目的蛋白与内参蛋白表达灰度值的比值来表示相对蛋白量，用SPSS 23.0统计软件进行比较，Graphpadprism 8.0绘制柱状图。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

使用Trizol法提取细胞总RNA,检测RNA浓度和纯度，按照TaKaRa逆转录试剂盒(RR047)说明将RNA逆转录成cDNA,然后用TBGreen法(TaKaRa, RR820)以GAPDH为内参进行RT-qPCR,每个样本设3个复孔，记录Ct值，用2-△△Ct方法计算基因水平。

1.2.4 Per1基因干扰及过表达慢病毒载体转染CNE2细胞

制备密度为(3～5)×104个/mL CNE2细胞悬液，接种100μL细胞悬液于96孔板中。预感染时共需13个孔，进行慢病毒感染时细胞的融合率应为20%～40%。感染预实验共设置三组感染条件，每组均设置四个不同梯度MOI。用目的细胞培养基Normal(不含血清)将慢病毒梯度稀释成1×108 TU/mL、5×107 TU/mL、1×107 TU/mL、1×106 TU/mL 4个组，各50μL,对应步同梯度的MOI。吸掉上清液，按照说明书向各孔中加入相应体积的溶液混匀，继续培养。此时，1-4组加入的病毒量分别为1×106 TU、5×105 TU、1×105 TU、1×104 TU,细胞数目大约为1×104个，所以1～3组的MOI分别为100、50、10、1。用上述Real-time qPCR方法鉴定Per1基因的表达，相对定量分析F=2-△△Ct方法进行数据分析。

1.2.5划痕实验

取出四组细胞，以每孔4×105细胞接种到六孔板中，在培养基中培养到细胞密度达到90%左右，使用200μL枪头垂直与六孔板底部横线划痕，此时细胞表面呈井字划痕，拍取0 h照片，然后继续培养24 h、48 h后拍照记录细胞划痕愈合情况。显微镜下拍照观察并记录划痕距离(即24 h划痕距离),计算细胞迁移率。24 h细胞迁移率=(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%。每组设3个复孔，取平均值。

1.2.6 Transwell小室

在小室的上层先加入100μL的基质胶，在基质胶小室上层分别添加2×105细胞，下室均加入800μL的完全培养基，每组设3个复孔，在37℃、5%CO2条件下培养48 h后取出小室，用PBS冲洗2次洗去杂质，4%多聚甲醛固定20 min,适当风干后用0.1%结晶紫600μL/空染色20 min,清洗后用棉签擦拭小室内侧细胞，在正置显微镜下随机计数5个视野，取平均值。

1.3统计学分析

所有实验数据采用SPSS 23.0及Graphad Prism 8统计软件进行统计学结果分析；分析前先对数据进行正态性检验，P<0.05认为数据符合正态性。符合正态分布的数据，组间比较采用独立样本t检验，多组数据采用方差分析，P>0.05认为组间无差异性，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 RT-qPCR结果

Per1基因在CNE2细胞中较NP69细胞中表达下降，RT-qPCR结果显示Per1基因在CNE2细胞中的表达丰度为中，Per1基因干扰及过表达慢病毒载体转染CNE2细胞后，使用DNA测序验证靶向Per1基因干扰及过表达慢病毒质粒构建成功，如图1所示。

图1 Per1在CNE2及NP69中的表达差异  

A:Per1基因在CNE2细胞中表达丰度；B:Per1基因在NP69(鼻咽正常上皮细胞)及CNE2(鼻咽癌细胞)细胞中的表达数据图；C:Per1基因在NP69及CNE2表达条带图，**P<0.01。

2.2划痕实验结果

Per1-OE组较Per1-OENC组24 h、48 h细胞迁移率均明显下降(P=0.04,P=0.01),Per1-sh组较Per1-shNC组24 h、48 h细胞迁移率均明显升高(P=0.01,P=0.0),如图2所示。

图2干扰及过表达Per1后对鼻咽癌细胞CNE2迁移能力的影响  

A:四组细胞划痕实验图；B:四组细胞划痕实验数据分析图；

2.3 Transwell实验结果

Per1-sh组较Per1-shNC组穿过Transwell小室细胞数明显增加(250±6.5个vs 173±5.5个，P=0.02),Per1-OE组较Per1-OENC组穿过Transwell小室细胞数明显减少(109±3.1个vs 168±2个，P=0.001),如图3所示。

图3干扰及过表达Per1后对鼻咽癌细胞CNE2侵袭能力的影响(结晶紫染色×100) 

A:Per1-OE组；B:Per1-OENC组；C:Per1-sh组；D:Per1-shNC组；E:各组细胞侵袭实验及数据分析图，*P<0.05,**P<0.01。

2.4 Western bolt结果

JAK2、p-JAK2、STAT3蛋白在四组细胞中表达无统计学差异，均P>0.05。Per1-sh组较Per1-shNC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达升高，E-cadherin表达下降，均P<0.05,Per1-OE组较Per1-OENC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达均下降，E-cadherin表达升高，均P<0.05,如图4所示。

图4干扰及过表达Per1后对JAK2-STAT3信号通路相关蛋白及EMT相关蛋白表达的影响  

A:各组细胞蛋白表达条带图；B:各组细胞Per1蛋白相对表达量；C:干扰Per1基因后各蛋白表达数据分析图；D:过表达Per1基因后各蛋白表达数据分析图，

3、讨论

生物钟有助于预测代谢活动和维持稳态反应，时钟分子机制通过多组转录-翻译反馈环网络在单细胞水平上运行。Per1作为Per基因家族中核心成员，成为多种肿瘤发生发展中作用机制的研究热点。本课题组前期研究结果证明干扰Per1基因后可以促进NPC细胞CNE2侵袭、迁移，文献报道JAK2-STAT3信号通路的异常表达与NPC侵袭迁移相关[7,8],故本课题进一步探索过表达Per1基因后影响NPC细胞发生侵袭迁移的机制及与上皮-间质转化、JAK2-STAT3通路相关蛋白表达的相关性。

JAK-STAT信号通路由两个基因组组成：激酶Janus(Janus kinase)和转录因子STAT(signal transducer and activator of transcription),该通路在动物中高度保守，共同参与细胞对各类细胞因子和生长因子的应答作用。JAK2-STAT3是JAK-STAT信号通路家族中的重要成员，并且在许多类型的肿瘤中异常激活，可以调节肿瘤细胞增殖和凋亡、血管生成、侵袭和转移[9]。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指通过特定程序将上皮细胞转化为具有间充质表型细胞的生物学过程，是致癌过程中促进侵袭和转移的主要分子机制之一[10]。E-cadherin蛋白是一种位于上皮组织中的钙依赖性跨膜糖蛋白，可以防止和减少肿瘤细胞黏附，是发生EMT损失的重要标志。Vimentin是一种细胞骨架蛋白，广泛分布在成纤维细胞、内皮细胞和间质细胞中的淋巴细胞中。N-cadherin为钙黏着蛋白-2(CDH2)或神经钙黏着蛋白(NCAD),是人体由CDH2基因编码的蛋白质，其在多种组织中表达并起介导细胞-细胞黏附的功能的跨膜蛋白。在EMT期间，E-cadherin的表达下降而Vimentin、N-cadherin的表达增加[11]。

本研究细胞划痕实验结果显示：24 h、48 h Per1-OE组细胞迁移率较Per1-OENC组明显降低，Per1-sh组细胞迁移率较Per1-shNC组明显增高，通过Transwell实验得到Per1-OE组穿膜细胞数较Per1-OENC组明显减少，Per1-sh组穿膜细胞数较Per1-shNC组明显增高。WB检测四组细胞上皮-间充质转化EMT相关蛋白表达，结果显示：Per1-OE组较Per1-OENC组N-cadherin、Vimentin蛋白表达下降，E-cadherin蛋白表达升高，Per1-sh组较Per1-shNC组N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达下降。结果显示过表达Per1基因后可抑制NPC细胞CNE2的侵袭、迁移以及EMT相关蛋白的表达，干扰Per1基因后则相反，这与大多数研究一致。文献报道子宫内膜癌患者组织Per1较正常组织的表达显著降低，且Per1低表达的患者生存期更短。在人子宫内膜癌上皮细胞ishikawa中过表达Per1后与对照组相比在24 h、48 h、72 h过表达Per1可有效抑制ishikawa细胞增殖，侵袭实验显示Per1过表达的ishikawa细胞在24 h、48 h的侵袭力较对照组显著下降[12]。GUO等[13]在42例胰腺癌组织中检测到Per1的表达下降，并且Per1表达下降与患者总生存时间缩短具有显著相关性。在口腔鳞状细胞癌组织中Per1的表达显著低于邻近的非癌组织，Per1的表达与肿瘤大小、颈部淋巴结转移及TNM临床分期显著相关，Kaplan-Meier生存分析得出Per1表达水平低的患者5年生存率明显低于Per1表达高水平患者(40.7%和59.4%),多因素Cox分析显示Per1表达水平是口腔癌患者的独立预后因素[14]。

目前鲜有Per1基因在NPC细胞CNE2中对JAK2-STAT3信号通路表达影响的研究，而多数研究表明JAK2-STAT3通路的异常表达与NPC侵袭迁移相关，故我们猜测Per1基因影响NPC侵袭迁移可能与JAK2-STAT3通路相关蛋白的表达有相关性，基于此假设，我们将四组细胞采用WB检测JAK2-STAT3通路相关蛋白表达，虽然JAK2、p-JAK2、STAT3蛋白在四组细胞中表达无统计学意义，均P>0.05,但p-STAT3蛋白的表达在Per1-sh组中较Per1-shNC组表达升高，Per1-OE组较Per1-OENC组表达下降，提示Per1的表达与p-STAT3蛋白表达可能有相关性。p-STAT3作为STAT3的活性产物，且多数研究已证实EMT相关蛋白位于JAK2-STAT3信号通路的下游，故Per1基因影响NPC细胞CNE2的EMT行为是否与该通路有关，亦有待进一步的深入研究。

本研究结果与大多数研究的一致。在头颈部鳞癌组织行免疫组织化学染色发现微血管密度显著增加，利用AG490(JAK2-STAT3通路抑制剂)后发现在体内外抑制JAK2-STAT3信号通路后可降低VEGFA和HIF1-α的表达，从而抑制血管生成。此外，在头颈部鳞癌转基因小鼠模型中，抑制JAK2-STAT3信号通路还可以通过抑制VEGFA和JAK2减少肿瘤微环境中的骨髓来源的抑制细胞，抑制头颈部鳞癌发生侵袭、迁移[15]。有研究表明NPC组织中STAT3表达升高，分析得出STAT3表达阴性的患者较表达阳性的患者有更高的生存率，同时STAT3的表达与肿瘤分期、淋巴结转移和患者预后有关[7]。逄明杰等[8]研究中显示，在NPC组织中JAK2和STAT3呈现高表达，并与患者的临床分期和淋巴结转移显著相关，提示JAK2和STAT3的高表达可作为预后的独立危险因素。在一项对2 994份乳腺癌样本的研究中显示乳腺癌组织中JAK2的表达显著上调，与分期及分子病理学有关[16]。p-STAT3作为STAT3的活性产物，进入核内调节靶基因转录，其高表达与生存率降低有关，可作为预测肿瘤进展的生物标志物及独立的预后因素。最近研究证实，一种新型选择性化合物NSC13626可以通过抑制细胞生长、阻止细胞S期的转化和下调JAK2-STAT3通路中STAT3的磷酸化来治疗结直肠癌[17,18]。JAK2-STAT3信号通路能介导肺癌细胞转移，STAT3主要由非小细胞肺细胞系(NSCLC)中Y705的JAK2依赖性磷酸化激活，可能是通过丝裂原活化的蛋白激酶和EGFR的突变和抑制[19]。此外，JAK2-STAT3信号通路活化后可上调VEGF和NSCLC中碱性成纤维细胞生长因子表达，进而促进血管生成[10]。据报道，JAK2和STAT3蛋白在所有胃癌细胞系中均以较高水平表达，G17通过CCK2R介导的JAK2 - STAT3 -PI3K -Akt信号通路诱导依赖性COX-2表达进而促进胃癌细胞增殖。有研究表明，阿昔替尼和AG490(JAK2-STAT3通路抑制剂)的协同作用通过VEGFR2 - JAK2 -STAT3信号通路介导的EMT在体外增强宫颈癌的抗肿瘤作用[10]。对肝癌细胞系进行JAK2敲除并进行体内、体外研究，确定了JAK2是调控肝癌进展的关键信号通路，结果显示JAK2 -STAT3途径的激活是炎症导致肝癌发生的常见机制，并作为驱动肝肿瘤形成的诱导因子，尤其是IL-6-JAK2-STAT3信号通路的异常激活，可导致控制增殖、血管生成、干性、免疫监视、侵袭和转移等的下游靶基因失调[20]。针对JAK2-STAT3信号通路研发的特异性抑制剂显示出有益的结果，这将为恶性肿瘤的治疗带来新的希望。

本研究将NPC细胞CNE2中Per1基因过表达后发现可抑制其侵袭、迁移，干扰Per1后则结果相反，表明Per1基因在NPC细胞CNE2中可能扮演着抑癌基因的角色，并发现Per1的表达可能与p-STAT3的表达有一定的相关性，具体作用机制需进一步研究。本研究在细胞层面进行，还需分析Per1基因在对NPC细胞CNE2的上下游基因的表达变化，同时要深入、全面的从分子、组织、动物及临床水平上研究Per1、p-STAT3、EMT等相关指标与NPC患者治疗及预后之间的关系，探究其具体相互作用机制，为能成为NPC治疗中新的策略提供依据。

参考文献:

[4]周湾,罗盼,曾艳,等.鼻咽癌CNE2细胞生物钟基因Per1表达及其对生物学行为影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志.

[8]逢明杰,胡文婷,王宁宁,等.JAK2和STAT3在鼻咽癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系[J].现代肿瘤医学

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:82060555);贵州省卫生健康委科学技术基金项目(编号:gzwj-2022-022);贵州医科大学国家自然资金培育项目(编号:19NSP047);

文章来源:罗盼,吴伟莉,金风等.生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭迁移及与JAK2-STAT3通路相关蛋白表达的影响[J].现代肿瘤医学,2023,31(15):2823-2828.