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ABCG2及microRNA基因多态性与鼻咽癌易感性的关系

2023-10-13 59 上传者：管理员

摘要：探讨ABCG2及microRNA基因多态性与鼻咽癌易感性的关系。方法:2019年01月至2023年01月间我院肿瘤科住院的102例鼻咽癌患者作为研究对象，通过收集相关临床资料、采集鼻咽癌患者及健康人外周血并进行ABCG2基因、hsa-miR-499及hsa-miR-608基因多态性分析。结果:miR499:rs3746444(T→C)和miR608:rs4919510(C→G)在研究组和对照组之间存在差异(P<0.05)。通过风险因素分析，证实以rs3746444TT对照，rs3746444C变异基因型(TC+CC)个体发生鼻咽癌的危险增加45%(OR=1.45,95%CI=1.05～1.78),携带miR608:rs4919510(C→G)GC+GG的基因发生鼻咽癌是携带CC基因的1.53倍，(OR=1.53,95%CI=1.02～2.26);总和分析ABCG2 G34A基因GA+AA在鼻咽癌组的分布频率为57.84%,与对照组相比(32.00%)明显增高(OR=1.20,95%CI:1.02～1.42)。如果等位基因由G突变为A,发病风险亦明显提高(OR=1.18,95%CI:1.03～1.35);ABCG2 C421A等位基因由C突变为A,鼻咽癌发病风险亦明显增高(OR=1.12,95%CI:1.02～1.29)。ABCG2 G34A、ABCG2 C421A使鼻咽癌发病风险明显增高；2年患者生存率91.18%(93/102),患者性别、年龄、分化程度、吸烟、饮酒、EBV病毒感染及家族遗传史无差异(P>0.05),与TNM分期、淋巴结转移、ABCG2 G34A、ABCG2 C421A、miR499:rs3746444(T→C)及miR608:rs4919510(C→G)存在差异(P<0.05);miR499+G34A+C421A+miR608对鼻咽癌诊断价值最高。结论:ABCG2、miR499及miR608多态性与鼻咽癌易感性相关，影响患者预后，对鼻咽癌有一定的诊断价值。

关键词：
Epstein-Barr病毒(EBV)感染
三磷酸腺苷结合转运蛋白G家族成员2
微小RNA
易感性
鼻咽癌
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鼻咽癌是常见上皮源性恶性肿瘤，发病率具有地域及种族差异，在我国南方及东南亚国家高发[1]。鼻咽部结构复杂，顶部癌变高发，其次是外侧壁，具有淋巴结转移早、易远处转移及易复发的特点[2]。鼻咽癌易感性是多因素多基因共同作用的结果，已经证实与Epstein-Barr病毒(EBV)感染、环境及遗传因素相关。文献证实，鉴定鼻咽癌易感基因对于预测癌变发生风险并阐明其致病机制具有重要意义。三磷酸腺苷结合转运蛋白G家族成员2(ATP-binding cassette super G family member 2,ABCG2)是一种转运蛋白，基因定位于人染色体4q21-22,发挥转运多种底物进出细胞等作用，其在机体多个组织器官中存在表达，在胎盘中呈现高表达，而在大脑、小肠及肝脏等呈现低表达[3]。EKAPHOP等报道，在正常鼻炎组织及鼻咽癌组织中均存在ABCG2表达，但鼻咽癌组织中其表达显著升高，并与鼻咽癌耐药存在关联[4]。近些年，随着生物分子靶向技术的发展，已经了解微小RNAs与恶性肿瘤疾病发展存在关联。微小RNA(microRNA, miRNA)是由多个核苷酸组成的小分子RNA,具有转录、DNA调节、诱发mRNA降解及调节细胞生物活性等作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是表示基因组水平上单个核苷酸改善导致的DNA序列多态性，且包含转移、插入及缺失等多个形式[5]。在鼻咽癌疾病中了解SNPs有利于解释个体差异，特别是对肿瘤的易感性具有重要意义。本文研究通过收集本院住院治疗的102例鼻咽癌患者为研究对象，通过检测外周血ABCG2及miRNAs多态性结合患者临床特征，为早期诊断及临床干预提供参考依据。

1、资料与方法

1.1一般资料

收集2019年01月至2023年01月间我院肿瘤科住院的102例鼻咽癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)组织学确诊为鼻咽癌；(2)均未进行化疗、放疗、免疫相关药物及分子靶向药物治疗；(3)临床资料与随访资料完整者。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤患者；(2)自身免疫性疾病者；(3)参与其他临床项目者；(4)依从性较差者；(5)失访者；(6)其他原因导致的死亡。鼻咽癌男性71例、女性31例，年龄最小22岁，年龄最大78岁，中位年龄64岁；高分化、中分化及低分化分别为32例、51例及19例；临床TNM分期T1期28例、T2期31例、T3期23例及T4期20例；淋巴结转移45例，未转移57例。另选择同期体检的50例健康人作为对照，男性28例，女性22例，中位年龄62岁，所有研究对象或家属了解本研究内容并知情同意，本研究符合我院伦理规定。

1.2问卷调查及标本收集

采用自行编制的流行病学问卷调查，内容包含人口基本资料、家族遗传史、EB病毒、吸烟及饮酒等；由经过统一培训的调查员在患者确诊后7 d内进行访谈并进行相关内容填写。收取所有患者肘部静脉血2 mL,自然沉淀2 h, 3 500 r/min离心15 min,分离上层血浆将其放到-70℃冰箱中保存。

1.3基因分型

1.3.1 DNA提取

采用Tian Gen公司的0.1～2 mL血液基因组DNA提取试剂盒(Dp319-02),所有研究对象取2 mL外周血抗凝，依照说明书提取患者血浆中基因组DNA。

1.3.2 SNP位点的选择

SNP位点以GenBank和miRbase生物信息学数据库为基础，ABCG2基因ABCG2 G34A、ABCG2 C421A,miRNA成熟体的单核苷酸多态位点有hsa-miR-499(rs3746444 T→C)、hsa-miR-608(rs4919510 C→G)。

1.3.3 TaqMan基因型检测方法

利用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems, USA)设计所选的多态位点引物，委托ABI公司合成和校验(表1)。PCR反应体积为10μL,内含约200 ng的DNA 1μL,Master mix 5μL,上下引物均为0.1μL,探针为0.1μL,二次蒸馏水3.6μL。采用Applied Biosystems 2720的PCR基因扩增仪扩增，条件为95℃ 预热10 min, 95℃变性15 s, 60℃退火延伸60 s,共45个循环。用Applied Biosystems 7500仪器上的基因分型程序判断每个检测样本基因型。

表1 PCR引物序列

1.4测序验证

采用随机数字表法收取鼻咽癌患者及健康人员均20例样本，以上述基因进行PCR扩增，扩增产物送Invitrogen公司测序，以验证TaqMan检测结果真实性与准确性。

1.5统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行处理分析，对于连续型数据采用正态性检验，满足正态性且两组间方差齐情况下，进行t检验进行组间比较。非条件logistic回归分析多态位点与人群发生鼻咽癌关联。OR值及95%CI表示关联强度，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组研究对象一般资料比较

两组研究对象在性别、平均年龄、饮酒指标无差异(P>0.05),研究组吸烟、EBV病毒感染及家族遗传史占比高于对照组(P<0.05),其余指标无可比性，见表2。

2.2 miR499及miR608基因多态性与鼻咽癌易感性

miR499:rs3746444(T→C)和miR608:rs4919510(C→G)在研究组和对照组之间存在差异(P<0.05)。通过风险因素分析，证实以rs3746444TT对照，rs3746444C变异基因型(TC + CC)个体发生鼻咽癌的危险增加45%(OR=1.45,95%CI=1.05～1.78),携带miR608:rs4919510(C→G)GC+GG的基因发生鼻咽癌是携带CC基因的1.53倍(OR=1.53,95%CI= 1.02～2.26),见表3。

2.3 ABCG2多态性与鼻咽癌易感性

总和分析ABCG2 G34A基因GA+AA在鼻咽癌组的分布频率为57.84%,与对照组相比(32.00%)明显增高(OR=1.20,95%CI:1.02～1.42)。如果等位基因由G突变为A,发病风险亦明显提高(OR=1.18,95%CI:1.03～1.35);ABCG2 C421A等位基因由C突变为A,鼻咽癌发病风险亦明显增高(OR=1.12,95%CI:1.02～1.29)。ABCG2 G34A、ABCG2 C421A提高鼻咽癌发病风险，见表4。

表2两组研究对象一般资料比较

表3 miR499及miR608基因多态性与鼻咽癌易感性

表4 ABCG2多态性与鼻咽癌易感性

2.4鼻咽癌临床特征及基因分型与患者预后关系分析

2年患者生存率91.18%(93/102),患者生存率与性别、年龄、分化程度、吸烟、饮酒、EBV病毒感染及家族遗传史方面无关(P>0.05),与TNM分期、淋巴结转移、ABCG2 G34A、ABCG2 C421A、miR499:rs3746444(T→C)及miR608:rs4919510(C→G)有关，组间比较存在差异性(P<0.05),见表5。

表5鼻咽癌临床特征及基因分型与患者预后关系分析

2.5基因分型对鼻咽癌诊断价值分析

在鼻咽癌疾病诊断中，基因分型联合诊断高于单一基因分型检测，其中miR499+G34A+C421A+miR608诊断价值最高，灵敏度、特异度、准确度及AUC均较高，见表6和图1。

表6基因分型对鼻咽癌诊断价值分析

3、讨论

鼻咽癌是恶性程度较高的常见头颈部恶性肿瘤，病理类型主要以鳞癌为主，全球鼻咽癌发病率在1/10万以下，具有明显地域及种族性，我国南方以广东发病率最高，是其他欧美国家发病率的25～30倍[6,7,8]。鼻咽癌诱发因素较复杂，相关研究表示鼻咽癌发病率与基因多态性相关[9]。提示其内在机制有利于高危人群的筛选，有利于早期诊断及预后评估，对于提高患者预后具有重要意义[10]。

ABCG2基因是由655个氨基酸组成的跨膜蛋白，发挥转运功能主要是依赖ATP的外排泵，并主要在分泌及排泄功能正常的细胞浆膜内，可参与机体血脑及胎盘屏障而发挥其防御功能[11]。因ABCG2基因在药物吸收、分布过程中具有重要作用。肿瘤患者化疗过程中ABCG2基因可以通过降低化疗药物在肿瘤细胞内累积，可增加肿瘤耐药性[12]。目前关于ABCG2基因在鼻咽癌水平已经被多个文献证实，ABCG2基因在鼻咽癌组织及外周血中表达升高，与鼻咽炎及正常人存在差异[13]。体外培养的鼻咽癌细胞中可以检测ABCG2基因表达，采用托泊替康药物干预后ABCG2表达升高，说明ABCG2可提高鼻咽癌细胞耐药性[14]。但是关于ABCG2基因多态性与鼻咽癌之间的研究较少，本研究发现，ABCG2 G34A、ABCG2 C421A使鼻咽癌发病易感性明显增高。到目前为止，鼻咽癌基因组有多个SNP位点，且认为可以通过改变蛋白质活性而影响疾病的易感性[15]。ABCG2基因存在广泛的遗传多态性，且在不同人群中SNP位点具有数十个。亚洲人最常见的ABCG2基因多态性类型有ABCG2 G34A、ABCG2 C421A。在结肠癌中存在ABCG2 G34A突变，认为其突变后可以减少化疗药物疗效并通过降低ATP酶活性而减少ABCG2外排功能，提高结肠癌细胞对抗化疗药物的耐药性[16]。在ABCG2基因中ABCG2 C421A的外显子5是最重要的遗传变异之一，迄今为止，已有研究对ABCG2 C421A与非乳头状肾细胞癌、B细胞淋巴瘤和前列腺癌等易感性存在关联[17]。ABCG2 C421A多态对多种BCRP为底物的药物在体内的药物代谢动力学产生影响进而产生耐药性，在体外细胞实验中发现鼻咽癌细胞可以通过以BCRP为靶点，通过采用抑制药物可减少肿瘤耐药。因此，本文推测在鼻咽癌中ABCG2 G34A、ABCG2 C421A发生突变而能够加强癌细胞耐药。

本研究发现在鼻咽癌患者外周血中miR499及miR608基因多态性可以增加鼻咽癌易感性。miRNA属于内源性非编码RNA,通过RNA 3'非翻译区( 3'-untranslated region, 3'- UTR)可与靶基因进行配对后发挥RNA降解或翻译功能[18]。

在鼻咽癌中发现了大量miRNA参与癌细胞生长、分化及增殖等过程，作用与抑癌基因或癌基因相似[19]。以往文献发现miRNA多态性于肺癌、乳腺癌及鼻咽癌的发生发展及预后存在关联[20]。QIU等[21]研究发现在鼻咽癌miRNA成熟序列中8个SNP之间的关联与鼻咽癌易感性相关，并进一步通过实验显示转染miRNA的鼻咽癌细胞系608-rs4919510G及499-rs3746444等位基因表达载体比转染的细胞株产生菌落数量多，这可能是中国鼻咽癌的敏感生物标志物。ZHENG等[22]研究表示，miR-608 rs4919510CNG在鼻咽癌发病风险中的作用多态性与鼻咽癌风险、不良反应显著相关，rs4919510G变异的影响在鼻咽癌EBV患者中更为显著，该变异可能是评估鼻咽癌易感性的一个有价值的生物标记，本研究与之结果相似。

本研究发现，鼻咽癌患者生存率与TNM分期、淋巴结转移、ABCG2 G34A、ABCG2 C421A、miR499:rs3746444(T→C)及miR608:rs4919510(C→G)有关，通过对基因多态性检测有利于提高鼻咽癌诊断价值。鼻咽癌属于恶性程度较高的肿瘤，诊断初期往往存在TNM分期较高及淋巴结转移，并存在基因组不稳定现象，易产生基因突变可促进癌细胞多种耐药表型出现，导致临床治疗效果较差。WU Y等[23]研究表示，对于鼻咽癌患者，缺乏十分有效的治疗方法，患者临床分期进展较快，生存率降低，预后不佳。鼻咽癌细胞中ABCG2表达异常，是导致细胞耐药发生机制之一，当其敲除时可以显著改善细胞耐药性，并认为与减少ABCG2基因突变相关进而改善预后[24]。在实体肿瘤中存在miRNA异常表达，可加快癌细胞增殖及分化，miR499:rs3746444及miR608:rs4919510多态性可通过加快鼻咽癌细胞增殖而加快病情恶化，从而降低生存率。本研究发现，在鼻咽癌疾病诊断中，基因分型联合诊断高于单一基因分型检测，其中miR499+G34A+C421A+miR608诊断价值最高，灵敏度、特异度、准确度及AUC均较高。ABCG2可能作为鼻咽癌不良预后的分子表面标记物，并可能有效预测鼻咽癌对放疗、化疗的耐药性，通过检测ABCG2多态性有利于疾病早期诊断。miR499:rs3746444及微阵列分析和实时定量PCR分析表明，rs4919510位点的C-G基因发生了倒转可能导致不同基因的表达异常，这些基因可能影响肿瘤的发展，因此早期检测有利于提高疾病诊断。

综上所述，ABCG2、miR499及miR608多态性与鼻咽癌易感性相关，影响患者预后，对鼻咽癌具有一定的诊断价值。

文章来源:陈敬林,粱荣鑫,王美均等.ABCG2及microRNA基因多态性与鼻咽癌易感性的关系[J].现代肿瘤医学,2023,31(21):3951-3956.