鼻咽癌是起源于鼻咽上皮的头颈部恶性肿瘤，国际癌症统计数据显示，2018年全球鼻咽癌新增病例高达129 079例[1]。东南亚和中国广东是鼻咽癌高发地区，虽然磁共振成像、调强放疗及同步放化疗已被广泛应用，但仍有30%患者最终出现复发和(或)远处转移，预后较差[2]。因此，阐明鼻咽癌转移的分子机制，有望为鼻咽癌治疗提供有效靶点。环状RNA(circRNA)是在哺乳动物细胞中普遍存在的具有共价闭合连续环结构的单链RNA,其通过直接与微小RNA(miRNA)结合间接调节miRNA靶基因的表达，参与调控癌细胞的恶性表型[3,4]。研究发现，circRNA结合基序蛋白(circRBM)33在胃癌组织标本、细胞株中显著上调，且CircRBM33的表达与胃癌的临床特征密切相关，沉默circRBM33可诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭[5]。然而，鼻咽癌中circRBM33的表达模式和功能仍有待阐明。miR-3196是胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的抑制因子，miR-3196高表达能够阻碍癌细胞的生长和转移[6,7]。miR-3196被预测为circRBM33的靶点，但circRBM33是否通过靶向miR-3196影响鼻咽癌进展尚不明确。本研究通过检测鼻咽癌组织中circRBM33、miR-3196表达水平，分析circRBM33、miR-3196的相互作用，揭示circRBM33靶向miR-3196对鼻咽癌细胞恶性表型的影响。

1、材料与方法

1.1 组织来源

收集2019年3月至2020年3月河南科技大学第一附属医院进行内镜下活检术并确诊的鼻咽癌患者33例(女12例，男21例，年龄31～71岁，中位年龄47岁)的癌组织和配对正常癌旁组织，所有组织切除后立即放入液氮中冷冻，并保存在-80 ℃冰箱。患者均诊断为非转移性鼻咽癌，术前未接受任何抗肿瘤治疗。本研究获得患者书面知情同意，并经医院伦理审查委员会审批。

1.2 细胞和试剂

人鼻咽癌细胞6-10B购自美国菌种保藏中心；将circRBM33小干扰RNA(si-circRBM33)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、miR-3196模拟物(miR-3196 mimics)、miRNA模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-3196抑制物(miR-3196 inhibitor, anti-miR-3196)、miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC组)、circRBM33过表达质粒(pcDNA-circRBM33)、空载质粒(pcDNA)、荧光素酶报告质粒购自广州锐博生物公司；miRNA逆转录试剂盒购自美国ABI;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自上海博谷生物公司；PrimeScript逆转录酶试剂盒、SYBR-Green Master Mix购自日本TaKaRa; 包被基质胶的Transwell小室购自美国Millipore公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、电化学发光(ECL)检测试剂盒、鼠源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、鼠源上皮表型E-钙黏蛋白(E-Cadherin)单克隆抗体、兔源神经钙黏素(N-cadherin)多克隆抗体、羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗购自北京百奥莱博生物公司。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circRBM33、miR-3196mRNA相对水平

使用Trizol试剂临床组织样本中提取总RNA,分别利用miRNA逆转录试剂盒、PrimeScript逆转录酶试剂盒合成miR-3196、circRBM33的互补DNA(cDNA),再用SYBR-Green Master Mix进行RT-qPCR。用2-ΔΔCt方法分析circRBM33和miR-3196的相对水平。miR-3196上游引物5′-CCTGTGTATGCATCCTCGACTG-3′,下游5′-CTGGCGTGTAATGGAGTCG-3′;circR-BM33上游引物5′-CCCAGAAGAAGGACAGTATGAA-3′,下游5′-TGTAACACCCTGAGAACTGAAAT-3′;U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH上游引物序列5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′,下游5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′。

1.4 细胞培养、实验分组及处理

6-10B细胞培养在RPMI1640培养基中，待其80%汇合时，按1∶2比例传代。将第三代对数期的6-10B细胞接种在24孔板上，每孔2×105个细胞，待其50%融合时，使用Lipofectamine2000将最终浓度为50 nmol/L的si-circRBM33、si-NC、miR-3196 mimics、miR-NC、si-circRBM33与anti-miR-NC、si-circRBM33与anti-miR-3196及终浓度为0.4 g/L的pcDNA、pcDNA-circRBM33分别转染至6-10B细胞，分别记为si-circRBM33组、si-NC组、miR-3196组、miR-NC组、si-circRBM33+anti-miR-NC组、si-circRBM33+anti-miR-3196组、pcDNA组、pcDNA-circRBM33组。收集转染48 h的6-10B细胞，RT-qPCR检测转染效果，进行后续实验。另取未处理的6-10B细胞作为对照(Con)组。

1.5 CCK-8法测定6-10B细胞活力

将转染48 h的6-10B细胞(1×104个)接种于96孔板，48 h后加入CCK-8溶液，每孔10 μl。37 ℃孵育2.5 h。细胞活力以用酶标仪测得的各孔在450 nm波长处的光密度(OD)值表示。

1.6 平板克隆实验测定6-10B细胞克隆形成数

将6-10B细胞接种于6孔细胞板，每孔3×102个细胞，放入培养箱孵育10～14 d直到出现肉眼可见细胞集落。菌落固定，室温下用0.5%结晶紫染色30 min。显微镜下进行计数(大于50个细胞的集落数量表示克隆形成数)。

1.7 划痕愈合实验测定6-10B细胞迁移

将6-10B细胞接种在6孔细胞板，每孔1×106个细胞，细胞融合为一层时用100 μl移液枪头尖端在细胞表面划一直线。每孔用磷酸盐缓冲液洗涤3次，200倍显微镜下测量划痕距离0 h。37 ℃培养箱孵育24 h后，显微镜下测量划痕距离24 h。划痕愈合率=(划痕距离0 h-划痕距离24 h)/划痕距离0 h×100%。

1.8 Transwell实验测定6-10B细胞侵袭

取100 μl细胞悬液(无血清培养基稀释)、500 μl含血清培养基分别加入预先包被基质胶的Transwell小室上腔、24孔板下腔。37 ℃孵育24 h后，无菌棉签除去未过膜细胞，用4%多聚甲醛和0.5%结晶紫分别固定和染色穿膜细胞。显微镜下进行细胞计数(随机选择5个视野),其均值作为细胞侵袭数量。

1.9 Western印迹测定6-10B细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表达

用RIPA缓冲液提取各组6-10B细胞蛋白，随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将得到的蛋白湿转到聚偏氟乙烯膜上，然后按照封闭、孵育一抗(GAPDH抗体为1∶10 000稀释，E-cadherin抗体为1∶500稀释，N-cadherin抗体为1∶800稀释)、孵育酶标二抗、化学发光显色步骤进行。凝胶成像仪进行成像，并分析E-cadherin和N-cadherin蛋白相对表达水平。

1.10 双荧光素酶报告实验

根据StarBase数据库预测结果合成含有miR-3196结合位点序列的circRBM33野生型(WT)荧光素酶报告载体wt-circRBM33、突变型(MUT)荧光素酶报告载体MUT-circRBM33。分别将上述报告基因载体分别与miR-NC、miR-3196 mimics共转染至6-10B细胞。转染48 h后，将细胞裂解，并用荧光素酶检测试剂盒检测，荧光素酶活性归一化为海肾荧光素酶活性。

1.11 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2、结果

2.1 鼻咽癌组织circRBM33和miR-3196表达

与癌旁组织(1.00±0.06)相比，鼻咽癌组织中circRBM33相对表达(4.29±0.35)明显升高(t=53.223、P=0.000),鼻咽癌组织中miR-3196相对(0.35±0.03)较癌旁组织(1.00±0.09))明显下降(t=39.359、P=0.000)。

2.2 干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的影响

si-circRBM33组6-10B细胞中circRBM33相对表达较Con组、si-NC组显著降低(P<0.05),提示转染si-circRBM33后6-10B细胞中circRBM33表达受到抑制。si-circRBM33组与si-NC组、Con组比较，6-10B细胞OD值明显下降，克隆形成数和细胞侵袭数量明显减少，划痕愈合率与N-cadherin蛋白表达明显下降，E-cadherin蛋白表达明显增高(P<0.05)。见图1、图2、图3、表1。

图1 干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞迁移、 侵袭相关蛋白表达的影响   

图2 干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞 克隆形成的影响(结晶紫染色)   

图3 干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞迁移(×40)、 侵袭(结晶紫染色，×400)的影响  

表1 干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.3 过表达miR-3196影响鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭

miR-3196组6-10B细胞中miR-3196相对表达较Con组、miR-NC组显著增加(P<0.05),提示转染miR-3196 mimics后6-10B细胞中circRBM33表达上调。与Con组、miR-NC组比较，miR-3196组6-10B细胞OD值明显下降，克隆形成数和细胞侵袭数量明显减少，划痕愈合率与N-cadherin蛋白表达明显下降，E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图4、图5、图6、表2。

图4 过表达miR-3196对鼻咽癌6-10B细胞迁移、 侵袭相关蛋白表达的影响   

图5 各组6-10B细胞克隆形成(结晶紫染色)   

图6 各组6-10B细胞迁移(×40)和侵袭(结晶紫染色，×400)   

表2 过表达miR-3196对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.4 抑制miR-3196表达逆转了干扰circRBM33表达对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的作用

si-circRBM33+anti-miR-3196组与si-circRBM33+anti-miR-NC组相比，6-10B细胞中miR-3196的相对表达明显下降，细胞OD值、克隆形成数和细胞侵袭数、划痕愈合率、N-cadherin蛋白表达明显升高，E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.05)。见图4、图5、图6、表3。

2.5 circRBM33靶向miR-3196

StarBase预测显示miR-3196与circRBM33存在互补的核苷酸位点。见图7。双荧光素酶报告实验结果显示，同与WT-circRBM33共转染，与转染miR-NC组(1.02±0.07)比较，转染miR-3196 mimics细胞相对荧光素酶活性(0.42±0.04)显著降低(t=22.326、P=0.000)。pcDNA-circRBM33组6-10B细胞中miR-3196相对表达(0.35±0.03)显著低于pcDNA组(1.00±0.00;t=65.000、P<0.05);si-circRBM33组6-10B细胞中miR-3196相对表达(2.29±0.27)明显高于si-NC组(1.02±0.05;t=13.875、P<0.05)。

表3 抑制miR-3196表达恢复了干扰circRBM33对鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的作用

图7 circRBM33与miR-3196互补的核苷酸序列  

3、讨论

既往研究显示，circRNA通过调节鼻咽癌细胞恶性行为在鼻咽癌发病、进展中具有重要作用，Hong等[8]研究发现，circRNA富含半胱氨酸型运动神经元蛋白(circCRIM)1通过竞争性结合与miR-422a结合，阻止miR-422a对其靶基因叉头框蛋白(FOX)Q1的抑制作用，最终导致鼻咽癌转移、上皮间质转化(EMT)和多西紫杉醇耐药，circCRIM1高表达提示鼻咽癌患者预后不良。Ke等[9]指出，沉默circRNA同源结构域相互作用蛋白激酶(circHIPK)3可降低鼻咽癌细胞在体内外的生长和转移能力。因此，阐明circRNA在鼻咽癌中的作用可为鼻咽癌治疗提供潜在有效靶点。本研究结果表明，circRBM33在鼻咽癌组织中上调表达，干扰circRBM33表达能够抑制6-10B细胞的迁移、侵袭和增殖能力。EMT是肿瘤进展、转移的重要步骤，多项研究发现，肿瘤细胞间充质细胞表型的获得和细胞侵袭能力的增强关系密切[10,11]。此外，Ding等[12]研究发现，宫颈癌中circRBM33表达亦上调，敲除circRBM33明显抑制宫颈癌细胞增殖和转移，这与本研究中干扰circRBM33的抑制功能一致。

目前关于circRNA作用机制报道最为广泛的是和miRNA的相互作用。Chen等[13]研究发现，放疗抵抗鼻咽癌组织中circ_000543表达显著高于放射敏感鼻咽癌组织，敲减circ_000543通过靶向上调miR-9可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性。Li等[14]指出，miR-508-5p介导下调circ_0081534对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的抑制作用。据报道，肝癌组织中miR-3196表达下调，且miR-3196下调与肿瘤大小、临床病理分期相关，过表达miR-3196可抑制肝癌细胞生长，增加细胞凋亡[15]。miR-3196还可作为长链非编码RNA(lncRNA)的下游靶基因参与调控乳腺癌细胞增殖、糖酵解、凋亡、迁移和EMT过程[16,17]。本研究发现，鼻咽癌组织中miR-3196表达下调，过表达miR-3196可降低6-10B细胞迁移、侵袭和增殖能力，下调蛋白N-cadherin表达，上调蛋白E-cadherin表达，这与miR-3196在乳腺癌中抗癌作用吻合[17]。进一步研究表明，miR-3196是circRBM33的直接靶点，且circRBM33对miR-3196具有负性调控作用。由于干扰circRBM33表达与过表达miR-3196对6-10B的抗癌作用一致，提示6-10B细胞中可能存在circRBM33/miR-3196调控途径。本研究结果显示，抑制miR-3196表达显著逆转干扰circRBM33对6-10B细胞增殖、迁移和侵袭的影响，进一步证实circRBM33靶向miR-3196调控6-10B细胞恶性生物学行为。

综上，鼻咽癌组织中circRBM33表达上调，miR-3196表达下调。干扰circRBM33可抑制鼻咽癌6-10B细胞增殖、迁移和侵袭，其通过上调miR-3196表达实现。

基金资助:河南省科技攻关计划项目(132102310029);

文章来源:曾伟,马民,李燕伟等.circRBM33对鼻咽癌6-10B细胞增殖､迁移和侵袭的影响及其机制[J].中国老年学杂志,2023,43(20):5043-5048.