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基于网络药理学和细胞实验探讨雷公藤红素抗鼻咽癌的作用机制

2024-02-06 62 上传者：管理员

摘要：目的基于网络药理学和细胞实验探讨雷公藤红素抗鼻咽癌的作用机制。方法采用PubChem数据库获得雷公藤红素3D结构，导入Swisstarget获得前十潜在靶点。通过GeneCards数据库获得鼻咽癌疾靶点。将雷公藤红素与鼻咽癌交集靶点进行基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用Cytoscape软件构建“雷公藤红素-靶点-鼻咽癌-通路”关系网络图，取度值前五的核心靶点进行分子对接验证。MTT法、流式细胞术探究雷公藤红素对鼻咽癌CNE-1细胞的增殖凋亡影响。Western blot法检测IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表达。结果共获得2 143个鼻咽癌基因靶点和101个药物靶点，筛选出共同靶点38个，GO富集分析得到生物过程442条、细胞组成18条、分子功能35条，KEGG通路富集分析得到77条通路。雷公藤红素诱导CNE-1凋亡，并呈剂量依赖性，同时降低IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表达(P<0.05)。结论雷公藤红素能抑制CNE-1增殖，其抗鼻咽癌的机制可能是通过抑制IKBKB蛋白，从而抑制NF-κB信号通路激活。

关键词：
IKBKB
NF-κB
细胞实验
网络药理学
雷公藤红素
鼻咽癌
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鼻咽癌为鼻咽上皮肿瘤[1,2],2015年我国有6万例，其中3.4万例死亡[3],其治疗以放疗为主[4],但初步治疗5%～20%患者出现复发[5,6];到晚期以放化疗联合为主，可改善患者的生存情况，但引起的不良反应使其生存质量下降[7],故需开发抗肿瘤同时提高生存质量的药物。

植物活性成分具有益处多和副作用小一直被用作药物有效替代[8]。研究表明，雷公藤红素通过抑制自噬和NF-κB的异常激活作用骨关节炎[9],对MSCLC的影响是因蛋白酶体活性的抑制[10],降低microRNA-21抑制胃癌细胞生长转移[11],诱导耐药细胞凋亡通过ERK1/2和p38 MAPK[12],通过死亡受体和线粒体途径激活诱导鼻咽癌细胞凋亡[13]。雷公藤红素作用靶点多，机制复杂，故需进一步研究以确定它与鼻咽癌之间其他相互作用的靶点，阐明其机制。

网络药理学是将药物靶点与特定节点或模块间的交互作用结合起来的一种药理学方法，来阐明药物和靶点之间的联系[14]。本研究利用网络药理学和分子对接验证雷公藤红素的作用靶点、信号通路对鼻咽癌机制影响，再通过CNE-1细胞从实验来评价雷公藤红素药理作用，以期为后续研究提供依据。

1、材料

1.1 细胞株

人鼻咽癌细胞CNE-1(低分化)购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 药物

雷公藤红素购自成都乐美天医药科技有限公司，编号DL0035。

1.3 试剂与仪器

RPMI1640培养基(批号B1106022)、胎牛血清(批号BS1612-109)(美国Bioexplorer公司);青霉素-链霉素双抗溶液(批号BL505A)、PBS缓冲液(批号1401130)(合肥兰杰柯科技有限公司);AnnexinV 633Apoptosis Detection Kit(日本同仁化学公司，批号0600452);DMSO(美国Sigma公司，批号506008);兔抗IKBKB、NF-κB P65、Phospho-NF-κB P65、抗兔二抗(美国Affinity公司，批号DF6811、AF5006、AF2006、AF7018)。电泳仪、电泳槽、转印槽(北京普天新桥技术有限公司);BD FACSCelesta3激光流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

2、方法

2.1 鼻咽癌靶点筛选

通过PubChem数据库搜索关键词“celastrol”,得到其3D结构，导入Swisstarget平台,得到相关预测靶点。再通过GeneCards数据库搜索关键词“鼻咽癌”,得到其相关靶点。通过微生信云平台绘制鼻咽癌与Celastrol的靶点交集图。

2.2 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络可视化构建及分析

将微生信云平台得到韦恩图中的雷公藤红素-鼻咽癌交集基因输入至STRING数据库(https: //string-db.org/),获取PPI网络图。

2.3 靶点生物功能注释及通路分析

在Metascape数据库中输入交集靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，得到相关靶点功能和通路。

2.4 “雷公藤红素-靶点-鼻咽癌-通路”网络图构建

收集雷公藤红素抗鼻咽癌的交集靶点和KEGG通路富集分析结果，导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“雷公藤红素-靶点-鼻咽癌-通路”关系网络图，获得度值前五的基因。

2.5 分子对接

采用Discovery studio分子对接软件建立药物分子与靶点的相关性。通过RCSB:PDB蛋白质数据库得到对应蛋白质结构，导入Discovery Studio中，初步预处理后通过加氢除水和结构简化优化结构，同时将雷公藤红素分子式和阳性药物5-氟尿嘧啶分子式从PunChem数据库下载，再导入软件构建分子结构，对接后获得LibDockScore, 生成配体-蛋白相互作用3D和2D平面图。

2.6 MTT法检测雷公藤红素对CNE-1细胞的增殖抑制作用

消化离心收集细胞，以每孔2.0×105的密度接种于96孔板上，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中过夜。第2天加入含雷公藤红素的培养基100 μL,浓度分别为0、2、4、6 μmol/L,培养24 h, 每组设置3个复孔，每孔加入25 μL MTT,孵育4 h, 吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO,避光慢摇10 min, 在570 nm波长处检测光密度，计算细胞抑制率。

2.7 流式细胞术检测雷公藤红素对鼻咽癌细胞的促凋亡作用

按“2.6”项下方法处理细胞，用无EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液洗涤，收集细胞，加入染色液，避光常温染色15 min, 按照相关试剂盒说明书操作检测细胞凋亡率。

2.8 Western blot法检测IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表达

将CNE-1细胞密度调整为5.0×105/mL,接种于6孔板中，每孔1.5 mL,培养过夜，分别加入0、4 μmol/L雷公藤红素继续培养24 h, 收集细胞，PBS清洗3次，裂解液冰上裂解30 min, 4 ℃、14 000 r/min离心5 min, 检测总蛋白浓度，变性，-80 ℃保存。SDS-PAGE电泳80 V,30 min; 120 V,60 min; 100 V,150 min, 封闭液37 ℃,30 min, TBST洗膜3次，加入一抗，室温孵育30 min, 4 ℃下孵育过夜，TBST清洗3次，室温二抗孵育2 h, TBST洗膜3次，条带短暂保存在4 ℃新鲜TBST中。采用ChemiDocTMMP全能型成像系统显影，以β-actin为内参，Image J软件计算蛋白表达。

2.9 统计学分析

通过SPSS 20.0软件进行处理，数据以表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 网络药理学研究

3.1.1 雷公藤红素潜在靶点预测

3D结构见图1,将其导入SwissTarget平台中获得雷公藤红素靶点，通过Probability排序，获得前10个基因名称和靶点，见表1。

图1 雷公藤红素3D结构

表1 雷公藤红素排名前十的潜在作用靶点

3.1.2 雷公藤红素与鼻咽癌相关的共同靶点

从GeneCards数据库中获得与鼻咽癌相关的基因靶点2 143个，将101个药物靶点基因与其筛选出共同交集靶点基因38个，即为雷公藤红素抗鼻咽癌的潜在靶点基因，见图2。

图2 雷公藤红素抗鼻咽癌潜在靶点

3.1.3 雷公藤红素与鼻咽癌相关靶点的PPI网络

将38个交集靶点导入STRING数据库，PPI网络图见图3。

图3 雷公藤红素抗鼻咽癌PPI网络图

图4 GO功能富集分析

3.1.4 GO富集分析

得到生物过程(biological process, BP)442条、细胞组成(cellular component, CC)18条、分子功能(molecular function, MF)35条，将排名前十的三者利用微生信在线平台绘制成气泡图，见图4。由此可知，BP主要包括细胞对炎症反应的调节、对激素的反应、防御反应的调节、血管生成的调节、血管发育的调节等通路，CC主要包括粘着斑、细胞-基质连接、受体复合物、膜筏、膜微区细胞组成部分等通路，MF主要包括内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性、肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性等途径。

3.1.5 KEGG通路富集分析

共得到77条通路，根据P值排序，发现前15条通路包括肿瘤、新冠肺炎、PI3K-Akt、脂质与动脉粥样硬化、人T细胞白血病病毒1型感染等，气泡图见图5。由此可知，在肿瘤、PI3K-Akt等通路上富集较多。

图5 KEGG通路富集分析

3.1.6 “雷公藤红素-靶点-鼻咽癌-通路”网络模型

见图6,左侧38个绿色节点代表雷公藤红素抗鼻咽癌交集的靶点，根据节点度值按顺时针从大到小依次排列；右侧15个蓝色节点则对应了KEGG富集结果中的15条通路，连线显示了通路和靶点之间的相互作用，度值前五的基因为JAK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2。

图6 “雷公藤红素-靶点-鼻咽癌-通路”网络图

3.1.7 分子对接

将“3.1.6”项下排名前五的基因与雷公藤红素分别进行结合能力预测，同时以5-氟尿嘧啶作为阳性对照。结果显示，雷公藤红素与IKBKB和JAK2有较好结合活性，LibDockScore越高，结合越稳定。雷公藤红素与IKBKB的LibDockScore为94.266 3,与JAK2的LibDockScore为67.294 6,而5-氟尿嘧啶与IKBKB的LibDockScore为63.204 8。以3D作用图和2D相互作用图进行验证，见图7,可知雷公藤红素中的羟基与IKBKB中的CYS99形成氢键，雷公藤红素中的羰基与JAK2中的HIS950形成氢键，5-氟尿嘧啶中的嘧啶环3号氮和6号羟基分别与IKBKB中的SER436和ARG404形成氢键。因雷公藤红素与IKBKB的LibDockScore值远大于雷公藤红素与JAK2的，故后续分子实验围绕IKBKB进行。

图7 “活性成分-作用靶点”分子对接图

3.2 细胞实验

3.2.1 雷公藤红素对CNE1细胞增殖的影响

与对照组比较，雷公藤红素各剂量组细胞存活率降低(P<0.01),并呈剂量依赖性，见图8。

图8 雷公藤红素对CNE1细胞增殖的影响

3.2.2 雷公藤红素对CNE1细胞凋亡的影响

与对照组比较，雷公藤红素各剂量组细胞凋亡率升高(P<0.01),并呈剂量依赖性，见图9。

3.2.3 雷公藤红素对CNE-1细胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表达的影响

与对照组比较，雷公藤红素4 μmol/L组细胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表达降低(P<0.01),见图10。

4、讨论

鼻咽癌是一种鼻咽上皮里的恶性肿瘤。根据鼻咽癌发生的范围和位置，患者可能会出现鼻塞、鼻出血、伴有听力损伤的中耳炎、颈部肿块或其他神经症状，比如头痛和面部麻木[15]。鼻咽癌患者在放疗时会诱发口干症[16]。还会导致口腔溃疡发炎、嘴唇活动受阻、饮食困难、甚至脑脊髓并发症等一系列不良反应[17]。

图9 雷公藤红素对CNE1细胞凋亡的影响

中医药目前已获得广泛的抗肿瘤临床应用，在延长患者的生命、提高其生活质量等方面的作用得到了更多的肯定[18]。Chan等[19]研究表明，雷公藤红素通过抑制CXCR4相关信号和抑制体内肿瘤生长对肝细胞癌的潜在抗癌作用。Lin等[20]研究表明，雷公藤红素促进口腔癌细胞凋亡，其机制是诱导JNK1/2信号通路。

本研究分析了雷公藤红素“药物-靶点-疾病-通路”网络模型，结果显示JAK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2等度值较高，是雷公藤红素治疗鼻咽癌的关键潜在靶点基因。再结合分子对接分析，结果显示雷公藤红素与IKBKB和JAK2有较好结合活性，故推测IKBKB为雷公藤红素作用于鼻咽癌的主要靶点基因。IKBKB(又名为IKKβ)是IKK复合体中一个重要的催化亚基，IKBKB与催化亚基IKKα以及调节亚基IKKγ结合而形成IKK复合物。在组成IKK复合物的催化亚基中，NF-κB的激活IKBKB起到不可或缺的作用[21]。故NF-κB信号通路是雷公藤红素作用于鼻咽癌的关键通路。李媛媛等[22]研究发现，肺腺癌细胞中敲除IKKβ可以降低NF-κB引起的炎症反应。Zhou等[23]研究发现，miR-429在神经母细胞瘤细胞系中表达下调，其可以诱导这些细胞系的细胞凋亡并抑制其增殖。miR-429可与IKKβmRNA的3′-UTR结合，过度表达IKKβ可逆转细胞增殖，阻断miR-429的作用，说明miR-429作为肿瘤抑制因子的机制为与IKKβ相互作用，IKKβ是激活NF-κB核转运的IKK复合物的催化亚单位。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接进行预测，而后通过细胞实验和分子实验等对雷公藤红素抗鼻咽癌的机制进行了多维度深层次的研究，为未来鼻咽癌相关实验及临床治疗提供了重要的参考依据。

参考文献:

[7]司广宇.局部晚期鼻咽癌行同期放化疗治疗临床分析[J].临床医药文献电子杂志,2016,3(05):881-884.

[8]路维琳.中草药的毒副作用原理及预防策略[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(21):151.

[16]陈红,王维,李配富,等.养阴祛邪法治疗鼻咽癌放疗后口干症的效果[J].中国医药导报,2020,17(10):130-133.

[17]喻凤,王林林.中医药治疗鼻咽癌研究进展[J].中医眼耳鼻喉杂志,2019,9(2):99-101.

[18]李小江,邬明歆,孔凡铭,等.中药有效成分抗肿瘤活性及作用机制研究进展[J].中草药,2020,51(9):2587-2592.

[21]齐康,李洋,李雪冰,等.IKBKB在人肺腺癌细胞株A549及其耐药细胞株A549/DDP中的表达和意义[J].中国肺癌杂志,2014,17(5):363-368.

[22]李媛媛,李忠尧,毕悦,等.NF-κB介导的神经炎症在脑膜癌病中的研究[J].脑与神经疾病杂志,2020,28(1):28-32.

基金资助:云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(202201AY070001-013);2022年度云南省教育厅科学研究基金教师类一般项目(2022J0214);昆明医科大学硕士研究生创新基金项目(2021s097);

文章来源:王婷,张黎,储永双等.基于网络药理学和细胞实验探讨雷公藤红素抗鼻咽癌的作用机制[J].中成药,2024,46(01):304-309.