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LncRNAs-MEG3对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2024-02-20 19 上传者：管理员

摘要：目的:研究长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNAs-MEG3)对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其可能机制。方法:体外培养鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2,转染MEG3后分为空白对照组(NC)、阴性转染组(阴性对照质粒转染)和实验组(MEG3 mimis质粒转染)。采用实时定量PCR检测鼻咽癌细胞中LncRNAs-MEG3含量，CCK-8检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与正常鼻咽上皮细胞系NP69相比，鼻咽癌细胞中MEG3的表达明显降低(0.62±0.04)(P<0.05)。与空白对照组、阴性转染组相比，实验组中MEG3 mRNA的表达升高(5.31±0.12)(F=441.062,P<0.01),同时检测到鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭均减少(F=10.832,P<0.05;F=1 534.134,P<0.05;F=1 430.212,P<0.05),凋亡增多(F=798.066,P<0.05),差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:MEG3在鼻咽癌中的表达降低，提高MEG3表达则能够抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进细胞的凋亡，机制可能与抑制上皮-间质转化有关。

关键词：
侵袭
凋亡
增殖
母系表达基因3
长链非编码RNA
鼻咽癌细胞
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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生在鼻咽部的上皮源性恶性肿瘤，它好发于我国南方地区且呈明显的家族聚集性。由于发病部位隐匿，多数患者确诊时都已达到晚期，此时即便积极治疗，鼻咽局部或颈部淋巴结的癌灶仍较易残留或复发，这些都极大影响着这一群体的总体生存率[1]。因此，寻求新的治疗方法改善NPC患者的治疗效果显得尤为重要。

癌症是会随着时间推移而逐渐发生表观遗传变化的动态过程，其中我们将长度超过200个核苷酸的调控性非编码RNA命名为长链非编码RNAs(LncRNAs),它缺乏蛋白编码能力，但研究显示它的表达异常跟多种肿瘤的发生发展有关[2];母系表达基因3(maternally expressed gene3,MEG3)是LncRNAs中的一员，位于人类染色体14q32.3上，研究表明它存在于包括鼻咽癌在内的多种肿瘤中，作为多种miRNAs的竞争性内源RNA通过下调表达进而影响目标mRNAs的表达水平，从而达到抑制肿瘤生长的目的[3],但确切机制尚不清楚。

本研究拟通过在鼻咽癌细胞中转染MEG3,检测它的表达情况以及对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响，并探讨其可能机制，旨在为临床上针对鼻咽癌的可能靶向治疗提供一些思路。

1、材料与方法

1.1 细胞培养

鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2和正常鼻咽上皮细胞系NP69均购自上海中国科学院细胞库。取回细胞系置于 37 ℃水浴溶化后离心5 min弃去上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞长至约80%时弃去培养基，PBS冲洗细胞后用0.2%胰酶消化5 min, 再进行传代培养，直至培养到第3代时再用作后续研究。

1.2 实时定量PCR(qRT-PCR)

RNA试剂盒分离出细胞RNA,再反转录为cDNA,qRT-PCR试剂盒行qRT-PCR反应检测MEG3表达水平。MEG3引物序列如下：F:5'-GGGAAGGGACCTCGAATGTG-3',R:5'-CTGTCCCGTGGGAATAGGTG-3';以U6作为内参，对照引物序列如下：F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3',R:5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3',和RT引物5'- AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。采用2-ΔΔCt法计算MEG3相对表达量。

1.3 转染和分组

取培养至对数期的鼻咽癌细胞，提前1 h置于不含胎牛血清的培养液中，参照Lipofectamine2000试剂盒(Invitrogen, 美国)进行转染，并分成空白对照组(NC)、阴性转染组(阴性对照质粒转染)和实验组(MEG3 mimis质粒转染)。

1.4 CCK-8检测细胞增殖情况

用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)按说明书进行测定：将细胞接种至96孔板中，分别于转染后0、24、48、72、96 h加入10% CCK-8溶液100 μL,37 ℃孵育2 h, 微板仪中OD450 nm下测定孔内光密度值。

1.5 Transwell检测细胞的迁移和侵袭

制备各组转染细胞的单细胞悬液，将细胞密度调整为1×105个/mL,Transwell小室上室中加入细胞悬液，下室中加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养24 h后取出上室细胞、固定细胞、结晶紫染色，再在显微镜下对随机视野进行成像并分别计数。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

将转染后培养48 h的细胞用胰蛋白酶进行消化、离心，调整细胞密度为1×106个/mL,PBS洗涤，加入70%乙醇溶液固定过夜，PBS清洗后加入FITC和PI染色液，室温避光下孵育15 min, 于流式细胞仪中观察细胞凋亡情况、计数凋亡率。

1.7 统计分析

采用统计软件SPSS 21.0分析数据。计量资料均以均数±标准差描述，组间差异选用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各细胞系中MEG3的表达情况

qRT-PCR分别检测TW03、CNE-2和NP69细胞系中MEG3的表达情况，结果显示与正常鼻咽细胞组的表达量相比，鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2的表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),其中CNE-2细胞系的表达水平相对更低(F=54.270,P<0.01),见图1。因此后续研究取CNE-2细胞系。

图1 各组细胞系中MEG3的表达情况

2.2 CNE-2细胞转染后MEG3的表达情况

将转染后的CNE-2细胞行qRT-PCR以检测MEG3的表达量，结果显示：与NC组、阴性转染组相比，实验组中MEG3的表达量明显增高，差异有统计学意义(F=441.062,P<0.05),见图2。

图2 转染后各组MEG3的表达情况

2.3 转染后各组细胞的增殖情况

将转染后的各组细胞用CCK-8检测增殖情况，结果显示：与NC组、阴性转染组相比，MEG3转染组的光密度值(OD值)随着孵育时间延长逐渐下降，尤其在96 h时效应最显著，差异有统计学意义(F=10.832,P<0.05),见图3。

图3 各组细胞增殖情况(OD值)

2.4 转染后各组细胞的迁移和侵袭情况

各组细胞用Transwell法检测迁移和侵袭情况，结果显示：与NC组、阴性转染组比较，MEG3转染组中细胞迁移、侵袭均显著减少，差异有统计学意义(F=1 534.134,P<0.05;F=1 430.212,P<0.05),见图4。

图4 各组细胞迁移、侵袭情况

2.5 转染后各组细胞的凋亡率

流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，结果显示：与NC组(3.73±0.12)%、阴性转染组(4.03±0.05)%比较，MEG3转染组的凋亡细胞率显著增加(8.13±0.14)%,差异有统计学意义(F=798.066,P<0.05),见图5。

图5 MEG3对CNE-2细胞凋亡的影响

3、讨论

LncRNAs不能编码蛋白质，却可参与多种基因的调控。近年来异常表达的LncRNAs被检测到广泛存在于多种肿瘤中，比如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等，进一步的研究发现它与肿瘤的性质和预后有较明显的相关性[4,5,6,7]。一些研究表明LncRNAs跟鼻咽癌的发生发展及预后也可能有关，但具体作用及相关机制尚未揭示清楚[8,9]。因此我们设计了本试验，旨在通过探讨LncRNAs跟鼻咽癌发生发展的关系，初步探究其产生作用的机制，以期为临床上针对鼻咽癌可能的靶向治疗提供思考方向。

MEG3是LncRNAs中的一员，其基因位于人类染色体14q32.3上，在哺乳动物许多正常组织如大脑、垂体等部位均有表达，而在许多恶性肿瘤中表达减少甚至几乎不表达，比如乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、脑胶质瘤等。许多研究发现MEG3可通过一些途径比如抑制恶性肿瘤侵袭、转移等起到抑制肿瘤发生发展的作用[10,11,12]。因此深入探究MEG3在肿瘤细胞中的异常表达机制，对明确其可能在鼻咽癌临床转归中起到的作用意义重大。

本研究结果显示与正常鼻咽上皮细胞相比，MEG3鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2中的表达水平明显减低，同时能观察到鼻咽癌细胞的生物学行为存在多效性调节；而转染后其MEG3的表达量明显增高，细胞凋亡率随之明显增加，表明在鼻咽癌细胞系中MEG3呈低表达，这与上述文献报道相符。此外，本实验通过CCK8检测细胞增殖和流式细胞仪检测凋亡还显示MEG3转染组可明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，表明过表达MEG3可能是通过抑制细胞周期参与调控鼻咽癌细胞增殖周期，从而达到抑制肿瘤生长的作用。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是获得性间充质细胞侵袭、迁移的生物过程，近年来的研究显示MEG3可能是通过参与EMT过程，进而影响肿瘤的侵袭、迁移过程，比如在对胃癌的研究中发现过表达LncRNAs, EMT分子标志物E-cadherin表达会上调，而胃癌细胞的侵袭迁移受到抑制[13];对乳腺癌的研究显示MEG3表达上调后，N-cadherin、vimentin等EMT标志物表达减少，乳腺癌细胞的侵袭迁移能力也随之降低[14]。

本研究结果显示与空白对照组、阴性转染组相比，MEG3转染组鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力均受到明显抑制，提示其在可能参与鼻咽癌细胞发生发展过程之外，对癌细胞的迁移和侵袭过程也能起到抑制作用，进而达到最终发挥肿瘤抑制的作用，而这个过程推测可能与MEG3参与影响EMT有关[15]。

综上，我们的研究验证了MEG3在鼻咽癌细胞中低表达，而过表达MEG3能够抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进鼻咽癌细胞的凋亡，机制可能与MEG3参与影响EMT以及调控鼻咽癌细胞增殖周期有关，这为未来临床靶向治疗鼻咽癌提供了一些新思路。但此次研究还只是在细胞水平进行探讨，MEG3所涉及的具体机制及可能的临床应用还有待未来更深入的研究来阐述。

参考文献:

[7]李雨珊,孙亚男.长链非编码RNA与鼻咽癌发生发展的研究进展 [J].现代肿瘤医学,2019,27(19):3524-3527.

[9]宁佳羽,包伟晶,周素娟,等.LncRNA-MEG3和KLF4在鼻咽癌发生发展中的作用及可能机制[J].肿瘤防治研究,2021,48(03):234-238.

[15]包伟晶,宁佳羽,周素娟,等.长链非编码RNA母系表达基因3在鼻咽癌细胞中的表达及临床意义[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2021,28(05):273-276.B

基金资助:福建省宁德市自然科学基金联合项目(编号:2022J15);

文章来源:宁佳羽,朱忠寿,魏日富等.LncRNAs-MEG3对鼻咽癌细胞增殖､迁移及侵袭的影响[J].现代肿瘤医学,2024,32(05):826-829.