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bFGF通过NF-κB信号通路抑制人子宫平滑肌收缩

2024-05-24 68 上传者：管理员

摘要：目的:探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人子宫平滑肌原代细胞(HUt SMCs)收缩功能的影响及其可能机制。方法:用不同浓度外源性bFGF对子宫平滑肌细胞进行干预，qRT-PCR法检测缝隙连接蛋白(CX43)、催产素受体(OXTR) mRNA水平，Western blot法检测CX43、OXTR蛋白表达；胶原收缩实验研究外源性bFGF对HUt SMCs收缩能力的影响；激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+水平。用外源性bFGF和JSH-23(NF-κB转录活性抑制剂)处理人子宫平滑肌原代细胞，Western blot法检测CX43和NF-κB p65蛋白表达；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HUt SMCs分泌的IL-6、IL-8水平。结果:bFGF可抑制HUt SMCs收缩相关分子(CX43、OXTR) mRNA和蛋白表达。bFGF可抑制HUt SMCs收缩能力并使细胞内Ca2+水平降低。bFGF上调人子宫平滑肌细胞NF-κB蛋白表达并下调CX43蛋白表达，促进其分泌IL-8,这种效应被JSH-23所逆转。结论:bFGF通过激活NF-κB通路发挥促炎作用并调控CX43表达，从而参与调节HUt SMCs的收缩能力。

关键词：
NF-κB通路
产后出血
分娩并发症
宫缩乏力
碱性成纤维细胞生长因子
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产后出血（postpartum hemorrhage,PPH）是一种严重的分娩并发症，因产后出血导致的死亡人数约占全球总孕产妇死亡人数的20%，是全球孕产妇死亡的首要原因。产后出血的主要原因为：宫缩乏力、胎盘因素、产道裂伤、凝血功能障碍，其中宫缩乏力是最常见的病因，占产后出血病因的60%～70%[1]。宫缩乏力性产后出血的发病机制是复杂、多因素的，但具体机制仍未阐明。生理性产后止血主要依靠子宫平滑肌的收缩和缩复作用，内、中、外三层子宫平滑肌呈不同排列方向相互交叉，协同收缩压迫血管达到止血的目的。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）是一种具有广泛生物活性的碱性多肽类生长因子，主要发挥促细胞生长、增殖等生物学作用[2]。也有文献报道，外源性bFGF抑制其他类型细胞的收缩表型[3,4],bFGF激活NF-κB通路促进气道平滑肌的炎症反应从而损伤气道平滑肌[5]。bFGF在孕妇血清中的表达水平较未孕时增加[6]，且妊娠晚期产后出血组孕妇血清bFGF浓度显著高于非产后出血组[7]。目前，bFGF是否参与调控子宫平滑肌细胞的收缩还未见报道。推测bFGF可能通过激活NF-κB通路影响子宫平滑肌的收缩从而引发宫缩乏力性产后出血。本研究以人子宫平滑肌原代细胞（HUt SMCs）为研究对象，用外源性bFGF进行干预，探索外源性bFGF对人子宫平滑肌细胞收缩功能的调控及机制，以期为进一步研究宫缩乏力性产后出血的发病机制以及预防和治疗提供依据。

1、材料与方法

1.1细胞培养

取实验室冻存的3～6代HUt SMCs进行复苏，加含已灭活的10%胎牛血清（Cellmax）、1%青霉素-链霉素（武汉Servicebio公司）的DMEM/F12（美国Gibco公司）培养基，置37℃、5%CO2培养箱培养，取对数生长期平滑肌细胞接种于6孔板。参考既往研究体外实验中常应用的外源性bFGF浓度[5,8,9,10]，设置梯度浓度（5、10、15、20、25ng/mL）外源性bFGF(Peprotech公司）用以处理原代HUt SMCs。

1.2方法

1.2.1细胞活性检测

取生长状态良好的原代HUt SMCs消化接种于96孔板，细胞贴壁后，加1、5、25ng/mL外源性bFGF，未作加药处理的孔作为对照组，培养48h，弃原培养基，加按CCK-8试剂盒（武汉启动子公司）说明书配置好的CCK-8工作液，以加工作液的无细胞孔作为空白对照组，避光条件下37℃孵育2h，在波长为450mm处用酶标仪检测每孔光密度值（OD值）。细胞存活率（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。

1.2.2 Western blot法检测相关蛋白水平

6孔板中加RI-PA裂解液（100μL/孔）置于冰上20min，提取细胞蛋白，BCA法测量蛋白浓度（碧云天生物）。10%SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴下300mA恒定电流将蛋白转移至PVDF膜（Millipore）。转膜完成后将膜放入5%脱脂奶粉中常温封闭1h,4℃摇床上一抗孵育过夜。一抗有CX43兔单抗（1∶1000，武汉三鹰公司）、OXTR兔单抗（1∶2000,Abmart）、NF-κB p65兔单抗（1∶1000，武汉三鹰公司）；β-actin兔单抗（1∶10000，武汉Abclonal公司）。次日用TBST在室温下摇床上洗涤，室温下孵育二抗（山羊抗兔，1∶10000)1h,ECL发光法进行曝光显影。用Image J软件分析条带灰度。

1.2.3实时荧光定量PCR

Trizol法提取各组细胞总RNA，采用逆转录试剂盒（南京Vazyme公司）按说明书操作将其逆转录，将逆转录合成的cDNA进行实时荧光定量PCR（南京Vazyme公司）。引物序列：CX43上游为5'-GGAGATGAG-CAGTCTGCCTTTC，下游为5'-TGAGCCAGGTACAAGAGTGT-GG;OXTR上游为5'-TCATCGTGTGCTGGACGCCTTT，下游为5'-CGTGAACAGCATGTAGATCCAGG;β-actin上游为5'-CCT-TCCTGGGCATGGAGTC，下游为5'-TGATCTTCATTGTGCT-GGGTG。采用2-△△CT相对定量法进行分析。

1.2.4胶原收缩实验检测细胞收缩能力

将1mg/mLⅠ型鼠尾胶原蛋白（美国Sigma公司）加至24孔板，待胶原溶液凝固，加原代HUt SMCs细胞悬液接种于24孔板，置37℃、5%CO2培养箱培养24～48h，细胞完全贴壁后换液加药，将胶原凝胶从孔板边缘轻轻分离，继续培养48h，在白光下拍摄并扫描。用Image J软件对胶原凝胶的表面进行量化。收缩百分比公式：（孔表面积-凝胶表面积）/孔表面积×100%，圈出的区域为收缩后凝胶表面积。

1.2.5细胞内钙成像实验

将原代HUt SMCs接种于激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿（Biosharp）培养，细胞完全贴壁后换液加药，继续培养48h后用HPSS溶液洗涤2～3遍，加按说明书稀释至工作浓度的Fluo-4 AM（碧云天）Ca2+指示试剂，避光条件下37℃、5%CO2培养箱孵育30min,HPSS溶液充分洗涤，激光共聚焦显微镜观察488mm激发光波长下的细胞并取5个不同视野拍照，用Image J软件计算子宫平滑肌细胞平均荧光强度。

1.2.6 ELISA检测IL-6、IL-8水平

收集各组HUt SMCs培养24/48h的条件培养基作为样品。使用ELISA试剂盒（武汉Abclonal公司）测定IL-6、IL-8水平。将各组样品加入抗体包被的96孔板，室温孵育2h。将100μL工作检测溶液加至每孔，室温孵育1h，加100μL底物溶液，加50μL终止液后终止反应。用酶标仪在450nm波长测量各孔OD值，根据梯度稀释的标准品OD值绘制标准曲线并求出样品浓度。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 8统计软件。数据用（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 bFGF对HUt SMCs的细胞活性无明显影响

CCK-8法检测结果显示，与正常对照组相比，1、5、25ng/mL bFGF对原代HUt SMCs存活率的影响差异无统计学意义，见图1。

图1 CCK-8法检测bFGF对HUt SMCs细胞活性的影响

2.2 bFGF抑制HUt SMCs的CX43、OXTR表达

排除外源性bFGF(25ng/mL）降低细胞活性的基础上，用梯度浓度的bFGF(5、10、15、20、25ng/mL）处理原代HUt SMCs 48h,Western blot检测结果显示CX43、OXTR蛋白表达水平低于空白对照组，且呈剂量依赖趋势；实时荧光定量PCR显示bFGF(25ng/mL）干预后OXTR、CX43 mRNA表达量均低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。bF-GF浓度为25ng/mL时Western blot结果差异最明显，因此采用此浓度进行后续实验。

2.3 bFGF降低HUt SMCs胞内Ca2+水平和收缩能力

用bFGF(25ng/mL）处理48h，激光共聚焦显微镜下观察发现，细胞内Ca2+水平明显降低，见图3。胶原收缩实验显示，与空白对照组相比，bFGF明显减弱子宫平滑肌细胞收缩的能力，见图4。

图2 bFGF抑制HUt SMCs的CX43、OXTR表达

图3激光共聚焦显微镜镜下观察细胞内Ca2+水平

图4收缩后胶原凝胶的表面积

2.4 bFGF上调NF-κB蛋白表达水平

梯度浓度的外源性bFGF(5、10、15、20、25ng/mL）处理48h后，Western blot检测结果显示HUt SMCs的NF-κB蛋白水平增高，且呈剂量依赖趋势（P<0.05），见图5。

2.5 bFGF激活NF-κB通路从而抑制HUt SMCs的CX43蛋白表达

Western blot检测结果显示，bFGF(25ng/mL）处理原代HUt SMCs 48h,NF-κB通路被激活，CX43蛋白表达水平下降，而NF-κB转录活性抑制剂JSH-23可逆转bFGF引起的CX43蛋白表达下降的效应（P<0.05），见图6。

2.6 bFGF激活NF-κB通路促进HUt SMCs分泌IL-8

bFGF干预48h可增加子宫平滑肌细胞分泌IL-8的水平（P<0.05),JSH-23可抑制由bFGF引起IL-8分泌水平升高（P<0.05),bFGF对HUt SMCs分泌IL-6的影响差异无统计学意义，见图7。

图5 Western blot检测bFGF处理48h后各组HUt SMCs中NF-κB蛋白相对表达量

图6 CX43及NF-κB通路的关键蛋白相对表达量

图7 ELISA检测HUt SMCs培养上清中IL-6、IL-8水平

3、讨论

目前已有研究提出宫缩乏力性产后出血“炎症”相关的发病机制。2015年报告了1例以子宫急性肌炎（PAM）为主要特征的难治性宫缩乏力性出血[11]。后续研究发现，PAM的子宫肌层缓激肽受体Ⅰ型（BR1）表达增加且表现为间质水肿的病理特征[12]。除子宫体部以外，难治性宫缩乏力性产后出血的子宫峡部也被证明存在一种类过敏的急性无菌性炎症反应[13]。宫缩乏力性产后出血孕妇分娩前的外周血中多种炎症因子的浓度升高[7,14]。多项研究证明一些炎症因子能影响人子宫平滑肌的收缩功能[15,16]。NF-κB通路是炎症相关的经典通路，在组织损伤、感染或疾病状态下被激活，既发挥促炎的作用，还能调控炎症的负反馈机制，炎症反应严重时可导致组织损伤[17]。NF-κB通路是否在宫缩乏力性产后出血中发挥效应需进一步研究。

bFGF在身体多器官组织中广泛存在，主要发挥促进细胞生长、增殖等生物学作用，还可通过激活NF-κB通路发挥促炎效应并促进细胞分泌IL-6、IL-8[5,18]，这与本实验中外源性bFGF干预后NF-κB通路激活且子宫平滑肌细胞分泌的IL-8水平增高结果一致。本研究还发现，子宫平滑肌细胞自身分泌IL-6的水平并不高且bFGF可能不是影响细胞分泌IL-6的关键因素。既往研究显示，外源性bFGF可对平滑肌的收缩力起到调控作用，外源性bFGF可抑制人气道平滑肌细胞收缩表型相关蛋白的表达，减弱心脏瓣膜肌成纤维细胞的收缩力并降低α-SMA蛋白表达[3,4]。本研究中胶原收缩实验较直观地呈现了外源性bFGF对人子宫平滑肌原代细胞收缩功能的影响，表明外源性bFGF可降低人子宫平滑肌细胞的收缩能力。

了解分娩时控制子宫平滑肌收缩的机制对深入研究宫缩乏力性产后出血的发病机制有关键意义。细胞缝隙连接蛋白43(CX43）是子宫肌层表达的最主要的缝隙连接蛋白，CX43在细胞膜上形成的间隙连接通道为子宫平滑肌细胞收缩控制提供了低电阻通道，使离子易通过间隙连接通道，保证子宫平滑肌收缩的协调性和同步性[19]。本研究发现，外源性bFGF干预可能通过激活NF-κB通路使人子宫平滑肌细胞CX43蛋白表达下降，且被NF-κB转录抑制剂JSH-23所逆转，这表明bFGF可能影响子宫平滑肌细胞之间间隙连接通道的形成，从而阻碍子宫平滑肌细胞之间离子交换。分娩时催产素与OXTR结合后通过促进细胞内Ca2+内流和诱导子宫内膜上皮产生前列腺素F2α引起肌肉收缩，子宫催产素与其受体之间的相互作用直接影响子宫平滑肌收缩的协调性，若二者之间失衡，则导致子宫收缩乏力[20]。Western blot检测显示，外源性bFGF降低了OXTR在子宫平滑肌细胞中的表达，但具体机制尚不清楚，需进一步实验证明。细胞胞浆内Ca2+与肌钙蛋白结合后形成的复合物使肌球蛋白磷酸化，而后磷酸化肌球蛋白与肌动蛋白相互作用引起平滑肌收缩。细胞胞浆内Ca2+减少时会引起平滑肌收缩乏力。本研究发现，bFGF可降低HUt SMC细胞内Ca2+水平进而抑制平滑肌的收缩。

综上所述，外源性bFGF干预人子宫原代平滑肌细胞后，平滑肌收缩蛋白CX43、OXTR表达下降，降低细胞内Ca2+水平及细胞收缩能力。此外，外源性bFGF通过激活NF-κB通路发挥促炎作用并抑制人子宫平滑肌原代细胞CX43蛋白表达，表明bFGF可能通过炎症通路参与宫缩乏力性产后出血的发生。今后将从动物模型层面深入研究bFGF调控子宫平滑肌收缩的机制，深入探索bFGF通过抑制子宫平滑肌收缩参与宫缩乏力性产后出血的机制，以期为预防和治疗产后出血提供新的证据和靶点。

基金资助:国家重点研发计划(No:2021YFC2701502);

文章来源:都园渊,朱盛兰,张慧婷,等.bFGF通过NF-κB信号通路抑制人子宫平滑肌收缩[J].现代妇产科进展,2024,33(05):357-361+368.