神经炎症反应在癫痫(EP)发展中起重要作用，小胶质细胞是中枢神经系统中巨噬细胞样免疫细胞，是炎症因子释放主体[1]。体内研究表明，抑制过度激活的小胶质细胞可以减轻EP[2],表明小胶质细胞可能是对抗EP的潜在治疗靶点。小胶质细胞可以通过极化方式转化为促炎表型M1型或抗炎表型M2型。M1型加重神经毒性，而M2型发挥神经保护作用。因此，将小胶质细胞从M1型转化至M2型可能是治疗EP发作的一种有前途的策略。双特异性磷酸酶-1(DUSP1)可以发挥苏氨酸和酪氨酸残基去磷酸化作用，是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路的关键负调控因子[3]。因此，DUSP1通过调节MAPK信号通路参与细胞生理活动、神经元轴突发育、神经保护和炎症反应。有研究报道表明，DUSP1与抑郁、焦虑和亨廷顿病等中枢神经活动异常相关[4-6]。因此，本研究拟通过构建高表达或低表达DUSP1蛋白小鼠模型，探究DUSP1对小鼠EP发作的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物与来源

C57BL/6小鼠36只，雄性，无特定病原体(SPF)级，4周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2021-0011。小鼠入组后饲养于SPF动物房中，饲养过程保证充足的饲料与水源，控制室内温度(24±2)℃,湿度(40±10)%,维持12 h/12 h光照循环。实验动物伦理审批号为2023-KY-024。

1.2实验材料

anti-DUSP1、anti-胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、anti-p-ERK1/2、anti-c-Jun氨基末端激酶(JNK)、anti-p-JNK、anti-p38 MAPK、anti-p-p38、anti-β-actin、辣根过氧化物酶(HRP)Goat anti-rat IgG(H+L)、HRP Goat anti-rabbit IgG(H+L);RNA提取试剂盒；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-10 ELISA试剂盒。

1.3实验动物分组

将小鼠分为对照(Con)组和EP组。颞叶EP模型构建前24 h取小鼠侧脑室分别注射携带乱序对照基因、DUSP1基因和DUSP1 siRNA基因的慢病毒载体(2×109TU/mL),剂量：5μL,坐标：以前囟为原点，前后-0.8 mm,坐标-1.5 mm,深度-4.5 mm。通过慢病毒转染技术分别构建DUSP1正常表达组(DUSP1normal组)、DUSP1高表达组(DUSP1over组)和DUSP1低表达组(DUSP1low组)小鼠，每组12只，将这些小鼠又分为DUSP1normal+Con组、DUSP1normal+EP组、DUSP1over+Con组、DUSP1over+EP组、DUSP1low+Con组、DUSP1low+EP组，每组6只。携带乱序对照基因、DUSP1基因和DUSP1 siRNA基因的慢病毒载体由广州锐博生物科技有限公司构建。为验证慢病毒载体转染效果，本研究另选取12只小鼠，分别注射基因载体，通过Western blot试验及RT-qPCR检测DUSP1/β-actin及DUSP1 mRNA表达水平。

1.4颞叶EP模型构建

取DUSP1normal+EP组、DUSP1over+EP组及DUSP1low+EP组小鼠禁食12 h,腹腔注射氯化锂溶液(125 mg/kg),20 h后，腹腔注射硫酸阿托品溶液(1 mg/mL),30 min后，腹腔注射盐酸匹罗卡品溶液(50 mg/kg),诱导颞叶EP发作，持续观察小鼠颞叶EP发作情况。参考Racine分级[7]标准记录小鼠注射完盐酸匹罗卡品溶液至EPⅣ级发作时的潜伏期，若小鼠2 h时内EP发作未达到Ⅳ级，则记录小鼠EP发作潜伏期为120 min。EP发作评估Racine分级标准：0级表现为无抽搐发作；Ⅰ级表现为面部和嘴抽动；Ⅱ级表现为频繁点头运动；Ⅲ级表现为单侧前肢阵挛；Ⅳ级表现为双侧前肢抽搐、时常身体立起；Ⅴ级表现为全面性强直-阵挛发作、即身体背曲强直和跌倒。取DUSP1normal+Con组、DUSP1over+Con组及DUSP1low+Con组小鼠，开展与EP模型构建相同操作，但注射溶液更换为生理盐水。

1.5 Western blot试验

取小鼠大脑颞叶组织，加入裂解液匀浆成单细胞溶液，静置30 min。以12 000 r/min离心15 min,收集上清液，检测各组蛋白水平，加入上样缓冲液，煮沸制备成样品。开展十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上蛋白条带湿法转移至聚偏二氟乙烯膜上，4%胎牛血清封闭抗原，加入不同水平第一抗体(anti-DUSP1、anti-p-ERK1/2、anti-ERK1/2、anti-p-JNK、anti-JNK、anti-p-p38、anti-p38、anti-β-actin),孵育12 h。洗净第一抗体后，加入HRP标记的第二抗体[Goat anti-rat IgG(H+L)、Goat anti-rabbit IgG(H+L)],孵育2 h。洗净第二抗体，滴加显色液，在化学发光成像仪下显影获得各个蛋白条带。

1.6 RT-q PCR

取小鼠大脑颞叶组织，放入液氮中碾碎，加入Trizol试剂混匀、振荡并静置10 min。加入氯仿，混匀、振荡并静置5 min。以12 000 r/min离心15 min,收集上层水相，加入等体积乙醇混匀、振荡并静置5 min,以12 000 r/min离心15 min,收集总RNA沉淀，加入适量焦碳酸二乙酯水溶解沉淀。取样品检测RNA纯度、水平与完整性。将总RNA反转录为环状DNA(cDNA)。最后取cDNA进行RT-qPCR,反应条件为95℃、10 min预变性，95℃、15 s 45个循环，60℃、1 min退火。定量分析以GAPDH基因表达为内参，结果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达水平。引物序列由广州锐博生物科技有限公司提供，见表1。

表1基因引物序列

1.7炎症细胞因子检测

将小鼠处死，取大脑颞叶组织，加入磷酸盐缓冲液，匀浆、振荡、静置，以12 000 r/min离心15 min,收集上清液用于炎症细胞因子水平检测。取ELISA试剂盒中预包被抗体样品板，分别加入不同水平标准品与待测样品，37℃孵育2 h;清洗样品孔，加入一抗稀释液，37℃孵育2 h;清洗样品孔，加入二抗稀释液，37℃孵育2 h;清洗样品孔，加入底物显色，约5 min终止显色反应。酶标仪450 nm波长处检查各孔吸光度值，通过标准品孔吸光度值计算出水平-吸光度值的标准曲线，根据标准曲线计算出各个样品中不同炎症细胞因子水平。

1.8统计学处理

采用SPSS23.0统计软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量以

表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 3组DUSP1/β-actin和DUSP1mRNA表达水平比较

与DUSP1normal组比较，DUSP1over组小鼠颞叶组织中DUSP1/β-actin及DUSP1mRNA表达水平均明显升高，而DUSP1low组小鼠颞叶组织中DUSP1/β-actin及DUSP1mRNA表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

图1 3组小鼠颞叶组织DUSP1蛋白条带

表2 3组DUSP1/β-actin和DUSP1mRNA表达水平 比较

2.2 3组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期比较

DUSP1normal+EP组、DUSP1over+EP组和DUSP1low+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期分别为(49.50±9.28)min、(92.69±20.49)min和(22.61±8.54)min,差异有统计学意义(F=77.72,P<0.001)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1over+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显延长，DUSP1low+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 6组小鼠颞叶组织中小胶质细胞极化标志物mRNA水平比较

与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1normal+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物CD16、TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05);M2型小胶质细胞极化标志物CD206、TGF-β、Arg1和Ym1mRNA水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1over+Con组与DUSP1low+Con组M1型和M2型小胶质细胞极化标志物mRNA水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1over+EP组M1型小胶质细胞极化标志物CD16、TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05);M2型小胶质细胞极化标志物CD206、TGF-β、Arg1和Ym1mRNA水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1low+EP组M1型小胶质细胞极化标志物CD16和IL-1βmRNA水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05);M1型小胶质细胞极化标志物TNF-α和iNOS mRNA水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1low+EP组M2型小胶质细胞极化标志物TGF-βmRNA水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);M2型小胶质细胞极化标志物CD206、Arg1和Ym1水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

表3 6组M1型小胶质细胞极化标志物mRNA水平比较

2.4 6组小鼠颞叶组织中炎症细胞因子水平比较

与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1normal+EP组炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均明显升高，IL-10水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1over+Con组和DUSP1low+Con组炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1over+EP组炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均明显降低，IL-10水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05);DUSP1low+EP组炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均明显升高，IL-10水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

2.5 6组小鼠颞叶组织中DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白表达水平比较

与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1normal+EP组DUSP1/β-actin表达水平明显降低，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38/β-actin表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05);与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1over+Con组和DUSP1low+Con组DUSP1/β-actin、p-ERK1/2、p-JNK和p-p38表达水平均无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1over+EP组DUSP1/β-actin表达水平明显升高，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05);DUSP1low+EP组DUSP1/β-actin表达水平明显降低，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38表达水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6、图2。

表4 6组M2型小胶质细胞极化标志物mRNA水平比较

表5 6组小鼠颞叶组织中炎症细胞因子水平比较

表6 6组小鼠颞叶组织中DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白表达水平比较

图2 6组小鼠颞叶组织中DUSP1、ERK1/2、JNK与p38蛋白表达条带

3、讨 论

颞叶EP是一类发病复杂且表型多样的中枢神经系统疾病[8]。氯化锂溶液-盐酸匹罗卡品溶液点燃颞叶EP属于化学点燃模型，可以很好地模拟临床患者病理学特征[9]。本研究结果显示，氯化锂溶液-盐酸匹罗卡品溶液点燃的颞叶EP小鼠基本都出现了前肢抽搐、时常身体立起症状，但对于DUSP1表达差异的小鼠，其潜伏期不同。与DUSP1normal+EP组比较，DUSP1low+EP组小鼠潜伏期明显缩短，但DUSP1over+EP组小鼠潜伏期明显延长，且3组小鼠在模型构建完成120min内EP症状没达到Ⅳ级。提示本研究颞叶EP模型构建成功，且小鼠EP发作潜伏期与DUSP1蛋白表达相关。

DUSP1在全身广泛表达，参与细胞分化、增殖及凋亡调节[10]。DUSP1可以使MAPK超家族成员去磷酸化并失活，属于MAPK的负调控因子[3]。MAPK超家族成员包含ERK1/2、JNK和p38。肝癌相关研究中，DUSP1被发现通过钝化ERK1/2/JNK活性减轻缺氧诱导因子-1α过度激活的影响，促进肝癌细胞增殖[11]。DUSP1也被报道参与多种中枢神经系统生理信号调控。CHOI等[12]早期研究显示，内源性DUSP1蛋白敲除能够明显提高谷氨酸神经毒性，促进细胞凋亡，同时高表达DUSP1能够明显减轻神经细胞凋亡。本研究结果显示，颞叶EP发作造成小鼠脑组织中ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平升高，而DUSP1过表达则导致EP小鼠中ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平降低，表明DUSP1发挥的抗EP作用与其抑制MAPK信号有关。MAPK信号在小胶质细胞活化和极化调控中起重要作用[13]。然而，与DUSP1normal+Con组比较，DUSP1over+Con组DUSP1表达水平虽然升高，但ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平却无明显变化，由此提示DUSP1对MAPK家族蛋白的影响需要在激活条件下发挥。

最近，DUSP1被证实通过抑制p38MAPK信号减弱小胶质细胞诱发的神经炎症反应[14]。本研究结果也显示DUSP1高表达能够抑制MAPK信号，促进M2型小胶质细胞活化。此外，低表达DUSP1与激活MAPK信号及促进小胶质M1极化相关[13-14]。小胶质细胞介导的神经炎症反应与颞叶EP病理发展进程相关。体外研究中，M1型小胶质细胞是由脂多糖或干扰素-γ刺激诱导形成，其特征包括释放几种细胞因子，如iNOS、CD68、IL-1β、IL-6和TNF-α。M2型小胶质细胞是由IL-4、IL-10和IL-13诱导，其特征包括Arg-1、CD206蛋白表达增加或IL-4、IL-10细胞因子释放增加[15]。有研究表明，与对照组比较，颞叶EP患者血清IL-1β、IL-6水平均升高[16]。FU等[17]报道表明，丙戊酸钠耐受EP小鼠表现出的持续EP发作与颞叶中小胶质细胞M1/M2型极化标志物比例增加相关。DENG等[18]研究表明，小鼠颞叶EP模型中，位于小胶质细胞膜表面的Runx1蛋白通过Notch1信号促进M2型小胶质细胞向M1型小胶质细胞极化，缩短EP潜伏期。这些研究表明M1型小胶质细胞介导的神经炎症反应与颞叶EP发作有关。本研究观察显示，颞叶EP发作潜伏期与小胶质细胞中M1型极化增加相关，M1型小胶质细胞极化标志物mRNA水平和炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均明显升高证明了这一点。小胶质细胞M1/M2型极化的改变在控制神经损伤的炎症反应中起关键作用。M1型小胶质细胞加剧神经毒性，而M2型小胶质细胞发挥神经保护作用。因此，提高小胶质细胞向M2型可极化是颞叶EP治疗的一种有前途的策略。本研究结果也证实了通过提高DUSP1表达能够明显促进M2型小胶质细胞极化。具体结果表现为，高表达DUSP1明显降低iNOS mRNA表达水平与炎症细胞因子(TNF-α、IL-6)释放。

本研究仍存在一些局限性。首先，高表达DUSP1或低表达DUSP1小鼠大脑颞叶组织中iNOS及Arg1蛋白表达水平并没有明显升高或降低，这可能涉及小胶质细胞活化/极化相关其他信号通路补偿，这些相关的信号通路可能也会成为EP治疗的潜在靶标。此外，通过体外实验探究高表达DUSP1能否促进小胶质细胞M2极化作用仍需进一步研究。

本研究意义在于揭示了DUSP1基因蛋白表达降低与EP发作相关。高表达DUSP1基因能够明显延长小鼠EP发作至Ⅳ级的潜伏期，其机制可能涉及抑制MAPK信号通路来调节小胶质细胞向M2型极化。因此，针对DUSP1基因设计相关生物制剂，诱导DUSP1蛋白表达，将有助于丰富EP的治疗选择。

基金资助:张家口市重点研发计划项目(1921091D);

文章来源:张靖,张宇,任倩玉,等.双特异性磷酸酶-1对小胶质细胞极化及颞叶癫痫发作的影响[J].检验医学与临床,2024,21(15):2230-2236.