癫痫为神经系统常见疾病，临床发病具有高度重复性，且持续时间较为短暂。由于脑部神经元异常过度放电所引起的中枢神经系统功能失常，随疾病进展可能增加神经损伤和死亡风险[1-2]。癫痫的临床机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制的不平衡导致癫痫发作，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。除此之外，炎症机制在癫痫的发生、发展中发挥重要作用，癫痫可诱导发作相关脑区炎症介质表达，此过程与癫痫活动产生及传播关系密切。由于临床当前尚无可靠的血清学指标用于癫痫的病情评估，故选取合适的生物标志物评估疾病严重程度有利于临床更好地开展治疗。研究显示，微小核糖核酸(miRNA)参与基因表达调控，并在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，部分miRNA可能参与中枢神经细胞疾病的发生和发展[3-4]。既往研究显示，miR-146a异常表达与星形胶质细胞发育异常相关，与中枢神经系统病变关系密切[5],但其在成人癫痫患者中的表达机制尚不清楚。

miR-125a在癫痫患儿中有较低表达，可以用于儿童癫痫的诊断工作[6],故认为其在成人癫痫中或许存在类似的表达机制。Toll样受体4(TLR4)由正、负调节因子共同控制，可以识别各种外源性及内源性分子信号跨膜受体，构成机体免疫应答，产生干扰素和炎症因子。越来越多的证据表明，TLR4的活化可能诱发癫痫发作[7],故认为TLR4可能参与成人癫痫的发生和发展。因此，本次研究探讨了成人癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平及其与疾病严重程度的关系，旨在为成人癫痫的诊治工作提供一定参考和依据。现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2020年8月至2023年8月新疆维吾尔自治区人民医院收治的69例癫痫患者作为癫痫组，另选取同期在本院体检的69例无重大疾病的健康者作为对照组。癫痫组中男37例、女32例，年龄42～60岁、平均(51.19±4.46)岁；对照组中男39例、女30例，年龄44～61岁、平均(52.34±4.38)岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入标准：(1)符合癫痫相关临床诊断标准[8];(2)经家族史、体格检查、现病史、脑电图、颅脑MRI或CT等确诊癫痫；(3)年龄>18岁。排除标准：(1)合并精神分裂症、双相障碍等；(2)合并神经及其他系统疾病；(3)3个月内有抗焦虑、抑郁情绪及影响认知功能用药史。本研究符合赫尔辛基宣言相关准则与要求，且经新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会审批通过(KY2019051562)。所有研究对象均知晓本研究，并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂

反转录试剂盒(日本Takara公司);实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(美国ABI科技有限公司生产，型号：ABI5800)。

1.3方法

1.3.1血清miR-146a、miR-125a水平检测

采集所有研究对象空腹静脉血5 mL,离心(3 000 r/min, 15 min)后收集血清，采用Trizol法提取总RNA,并反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR仪对cDNA进行扩增。miR-146a正向引物序列：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGT-3′,反向引物序列：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′;miR-125a正向引物序列：5′-CCGCTCGAGGGTAGGAGGTT-3′,反向引物序列：5′-CCTCTAGACCTCTGGGCCTC-3′。反应条件：95℃,15 s, 60℃,30 s, 35个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt计算miR-146a、miR-125a的相对表达量。

1.3.2炎症因子水平检测

采集患者空腹静脉血4 mL,离心并分离血清(2 000 r/min, 15 min)。采用酶联免疫吸附试验检测血清TLR4及白细胞介素(IL)-1β、IL-2,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.3.3癫痫严重程度评估[9]

癫痫组患者于癫痫发作12 h后进行脑电图检测(描记24 h)。根据脑电图检测结果对入组癫痫患者进行疾病严重程度分组：枕区α或β的节律出现不规则变化则为轻度组；枕区α或β的节律出现左右不对称变化，或出现局灶性δ波为中度组；有广泛弥漫性慢波或周期样放电变化为重度组。

1.4统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数或百分比表示，两组间比较采用χ2检验。符合正态分布且方差齐的计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用Pearson相关分析癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平与炎症因子水平的关系，采用Spearman相关分析癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平与疾病严重程度的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1癫痫组与对照组血清

miR-146a、miR-125a及TLR4水平比较 癫痫组血清miR-146a、miR-125a水平低于对照组，TLR4水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1癫痫组与对照组血清miR-146a、miR-125a及TLR4水平比较

2.2癫痫组与对照组血清IL-1β、IL-2、TNF-α水平比较

癫痫组血清IL-1β、IL-2和TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2癫痫组与对照组血清IL-1β、IL-2、TNF-α水平比较

2.3不同严重程度癫痫患者miR-146a、miR-125a、TLR4水平比较

脑电图检测结果显示，轻度组、中度组、重度组分别有23、25、21例。3组患者miR-146a、miR-125a及TLR4水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05);且血清miR-146a、miR-125a水平为轻度组>中度组>重度组，TLR4水平为轻度组<中度组<重度组，任意两组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3不同严重程度癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平比较

2.4不同严重程度癫痫患者血清IL-1β、IL-2、TNF-α水平比较 轻度组、中度组及重度组血清IL-1β、IL-2和TNF-α水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05);且血清IL-1β、IL-2和TNF-α水平均为轻度组<中度组<重度组，任意两组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4不同严重程度癫痫患者血清IL-1β、IL-2、TNF-α水平比较

2.5癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平与IL-1β、IL-2、TNF-α水平的相关性分析

Pearson相关分析结果显示，癫痫患者血清miR-146a、miR-125a水平与IL-1β、IL-2、TNF-α均呈负相关(P<0.05),而TLR4水平与IL-1β、IL-2、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平与IL-1β、IL-2、TNF-α水平的相关性分析

2.6癫痫患者血清miR-146a、miR-125a、TLR4水平与疾病严重程度的相关性分析

Spearman相关分析结果显示，miR-146a和miR-125a水平与疾病严重程度呈负相关(r=—0.354、—0.417,P<0.05),TLR4水平与疾病严重程度呈正相关(r=0.436,P<0.05)。

3、讨 论

癫痫是慢性反复发作短暂脑功能失调综合征，主要是由于神经系统中神经元异常兴奋并放电所致。炎症介质在癫痫中发挥了重要作用，血清miR炎症通路存在调控作用，临床检测具有可重复性强、周期较短等优点，有利于系统研究癫痫发作过程中涉及的相关基因表达变化，进而帮助癫痫的病情评估工作[10]。

有研究显示，癫痫发病与过程与炎症因子及神经系统炎症存在密切联系，且与脑损伤存在一定关系[11-13]。miR-146a、miR-125a均可参与神经系统功能调控，TLR4则参与人体炎症级联反应。郑希院等[14]在研究中报道，miR-146a在癫痫患者中呈高表达，且其水平与发作频繁、发作类型、发作程度相关，但该研究中并未详细分析miR-146a表达的具体机制及与炎症因子的关系。ABDEL RAOUF等[15]的研究发现，miR-125a参与癫痫的发生机制，可以作为儿童癫痫的诊断生物标志物，但可能受到样本量的影响，该研究还发现miR-125a与炎症因子之间无明显相关性。为进一步探讨癫痫发病的具体机制及其与神经功能及炎症因子的确切联系，以便更好开展诊治工作，本研究发现，癫痫组血清miR-146a、miR-125a水平低于对照组，TLR4水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。故推测miR-146a、miR-125a水平降低、TLR4水平升高可能参与癫痫发作的调控机制。分析其原因，癫痫发作时，会损伤患者脑组织中的星形胶质细胞，并激活相关信号通路，促进相关炎症反应发生，进而导致脑部生理环境及局部微环境发生变化。miR-146a参与机体炎症反应，并通过作用于基质细胞衍生因子受体4(CXCR4)后，使CXCR4表达水平升高，而CXCR4作是炎症抑制分子，可以抑制机体炎症反应水平，故认为miR-146a通过下调CXCR4表达加剧机体炎症反应，这或许是癫痫发生、进展的其中机制之一。除此之外，感染会促进miR-146a产生，并活化NF-κB信号通路，释放患者体内促炎性细胞因子分泌，故考虑miR-146a与NF-κB之间存在正反馈调节，这或许为癫痫患者疾病发生进展的另一机制[16]。miR-125a可在多种疾病中发挥重要作用，如癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病等，并通过调节凋亡相关基因对细胞增殖和凋亡产生重要影响[17-18]。LIU等[19]的研究发现，miR-125a-5p表达水平在癫痫大鼠海马中有显著下调，过表达miR-125a-5p可抑制其靶基因钙调素依赖性蛋白激酶Ⅳ(CAMK4)的激活。进而减少大鼠海马体癫痫发作次数与炎症水平。因miR-125a-5p由miR-125a前体的5′端臂加工而成，故而考虑miR-125a的表达或可参与机体内神经细胞的凋亡及炎症反应过程。TLR4作为一种跨膜蛋白参与固有免疫和适应性免疫。既往研究显示，脂多糖可刺激缺氧、缺糖状态下的小胶质细胞产生微泡，使小胶质细胞和星形胶质的形态和代谢发生改变，加重大鼠脑血管内皮细胞连接处的损伤，进而诱导TLR4水平升高，产生炎症级联反应[20]。本次研究中癫痫患者血清TLR4水平明显高于对照组，其原因可能是由于结合相应受体后，通过对NF-κB的信号通路进行刺激并诱导炎症因子的释放，进而导致癫痫的发生、进展[21];在癫痫状态下，患者脑部神经功能处于异常放电状态，可能引起缺氧反应。由于缺氧条件下，会改变脑部微血管的内皮细胞形态，使细胞突起减少，形态失去完整性，细胞之间紧密连接蛋白的表达量下降，进而诱发TLR4水平升高，或可能为其中的相关机制[22]。

本研究发现，癫痫组血清IL-1β、IL-2和TNF-α水平高于对照组(P<0.05)。IL-1β是由单核巨噬细胞分泌，并由半胱天冬酶-1蛋白水解加工成活性形式，参与多种细胞活动，细胞增殖、分化和凋亡等，通过促进炎症反应、破坏血脑屏障等促进癫痫发生[23]。IL-2主要是由CD4+T淋巴细胞分泌，促进淋巴细胞生长、增殖、分化，参与机体免疫应答。通过提高神经元细胞内游离Ca2+表达水平，进而控制神经兴奋性，最终诱导癫痫的发生[24]。TNF-α是一种多效细胞分子，在炎症反应、细胞凋亡和免疫系统发育中发挥重要作用。对胶质细胞内谷氨酸活性增强有促进作用，从而参与癫痫进展，还可促进机体炎症级联反应，并促进IL-2等癫痫相关细胞因子的表达[25]。本研究结果表明炎症介质在癫痫中发挥了重要作用。

本研究还发现，血清miR-146a、miR-125a水平均为轻度组>中度组>重度组，血清TLR4、IL-1β、IL-2和TNF-α水平均为轻度组<中度组<重度组，且Pearson相关分析结果显示，癫痫患者血清miR-146a、miR-125a水平与IL-1β、IL-2、TNF-α水平呈负相关(P<0.05),TLR4水平与IL-1β、IL-2、TNF-α水平呈正相关(P<0.05),证实了miR-146a、miR-125a对炎症通路的确切调控作用，故推测当miR-146a、miR-125a呈低表达水平，TLR4呈高表达水平时，抗炎作用削弱，可能导致癫痫患者神经炎症加重，进而促进疾病进展。Spearman相关分析结果显示，癫痫患者血清miR-146a和miR-125a水平与疾病严重程度呈负相关(P<0.05),TLR4水平与疾病严重程度呈正相关(P<0.05)。提示血清miR-146a、miR-125a、TLR4监测对于癫痫病情严重程度评估有一定的参考意义，炎症介质在癫痫进展中发挥重要作用，随着癫痫疾病严重程度加重，IL-1β、IL-2和TNF-α水平也明显增加。分析其原因，随癫痫病情进展，谷氨酸兴奋毒性增加，进一步诱导巨噬细胞形成，并促使自由基形成，使血脑屏障进一步受到破坏，增加炎症因子的释放。

综上所述，成人癫痫患者血清miR-146a、miR-125a水平降低下调，TLR4水平升高，三者与IL-1β、IL-2和TNF-α水平相关，可以用于评估癫痫的疾病严重程度。

参考文献:

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基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2019D01C149);

文章来源:仲婷,陆明佳,米尔古丽·艾麦特,等.成人癫痫患者血清miR-146a､miR-125a､TLR4水平及临床意义[J].检验医学与临床,2024,21(16):2362-2366.