研究表明，滋养层细胞浸润不足会引起妊娠期子宫螺旋小动脉血管重铸障碍，导致胎盘浅着床，引发胎盘源性疾病，如妊娠期高血压、先兆子痫等。胚胎异位着床时处于局部低氧状态，低氧水平是调节滋养层细胞迁移的关键因素[1]。在妊娠早期，低氧可刺激滋养层细胞侵袭能力增加。随着妊娠的进展，持续缺氧状态会不断刺激滋养层细胞的增殖、迁移并侵袭，甚至诱导自噬功能障碍，进而导致滋养层细胞的损伤[2]。因此，探索低氧水平下促进滋养层细胞损伤的分子机制并寻找可靠的生物标志物用于临床预防和诊断至关重要。

自噬是细胞内分解代谢的一种稳态机制，可将细胞内成分转移到溶酶体降解，以维持细胞稳态应激反应。在胎盘早期缺氧和营养受限的环境中，自噬有助于维持滋养层细胞内稳态[3]。但过度的自噬可能破坏细胞结构并诱导细胞损伤[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200bp的非编码RNA,参与多种生物学功能，可通过表观遗传调控、转录调控和转录后调控调节基因表达[5]。大量lncRNA与过度的细胞自噬相关[6]。lncRNA DANCR作为lncRNA的一种，可通过调控miRNA信号轴促进胶质瘤细胞自噬和增殖[7]。然而自噬是否参与妊娠相关疾病胎盘功能障碍的病理过程，滋养细胞是否存在过度自噬导致的氧化应激损伤有待进一步探索，lncRNA DANCR与自噬之间的关系尚不清楚。

HTR-8/SVneo细胞是一种永生化滋养细胞系，具有许多与人原代滋养细胞相似的特征，是研究胎盘功能和妊娠相关疾病的常用工具。本研究选择该细胞系作为研究对象，在低氧的培养条件下，诱导滋养层细胞自噬和损伤，探索沉默lncRNA DANCR对该过程的影响，从而为研究人类滋养层细胞损伤导致的妊娠疾病分子机制和新药研究提供参考。

1、材料与方法

1.1细胞和主要试剂

人绒毛外细胞滋养层衍生的转化细胞系HTR-8/SVneo(货号：CL-0765)购自武汉普诺赛；AG RNAex Pro RNA提取试剂(货号：AG21102)、Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒(货号：AG11615)和SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(货号：AG11701)购自湖南艾科瑞；全蛋白提取试剂盒(货号：BC3710)购自北京索莱宝；BCA检测试剂盒(货号：23225)购自赛默飞世尔；GAPDH(货号：14C10)、Beclin-1(货号：D40C5)购自美国Cell Signaling Technology; p62(货号：ab91526)和γH2AX(货号：ab229914)购自美国Abcam;碘化丙啶染液(货号：40710ES03)购自翌圣生物科技(上海);Lipo8000TM转染试剂(货号：C0533FT)购自上海碧云天；Fire-LumiTM荧光素酶检测试剂盒(货号：L00877C)购自金斯瑞；点突变试剂盒(货号：R401)购自日本Takara公司；miR-33b mimic、miR-567 mimic由百奥迈科合成。

1.2实验方法

1.2.1人胎盘滋养细胞系(HTR-8/SVneo)的常氧/低氧培养

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养细胞，置37℃、含5% CO2恒温细胞培养箱培养。细胞生长汇合度达90%时，按1∶3细胞传代。取对数生长期细胞进行实验。将细胞随机分为两组：常氧组置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱培养，低氧组则置于1% O2培养箱，低氧处理48h。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞基因表达水平

采用AG RNAex Pro RNA提取试剂从不同处理后的细胞中提取总RNA,测定RNA浓度和纯度。根据cDNA合成试剂盒说明书指示，将RNA反向转录成cDNA。使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒进行qRT-PCR。反应体系：cDNA模板1μg, 10μmol/L终浓度的上下游引物各0.4μL,2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10μL,ROX Reference Dye 0.4μL,RNase free water补充至20μL。反应程序：95℃预变性39s; 95℃5s, 60℃30s,共40个循环；72℃延伸5min。引物序列：lncRNA DANCR-F:5-AATGCAGCTGACCCTTACCC-3,lncRNA DANCR-R:5-GGCTTCGGTGTAGCAAGTCT-3;miR-133b-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,miR-133b-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT;U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGCGT;GAPDH-F:5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,GAPDH-R:5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3。目标基因相对表达量由2-ΔΔCt方法计算，lncRNA内参使用GAPDH,miR-133b内参使用U6,每次实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达

提取全蛋白提取试剂盒细胞中总蛋白，根据BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度。将提取的蛋白质加至蛋白上样缓冲液，95℃煮沸10min(每孔加载30μg样品)。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离(200V,25min),5%牛血清白蛋白室温密封1h。加GAPDH(1∶2000)、Beclin-1(1∶1500)、p62(1∶1000)和γH2AX(1∶1000)一抗，4℃孵育24h, TBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育1h。通过Odyssey双色红外荧光扫描成像系统获得图像，并通过图像分析软件Quantity One测量波段的灰度值。获得并比较每组目标条带值与内参条带值的比率。

1.2.4彗尾实验检测细胞损伤水平

通过彗星测定评估DNA损伤。37℃下，将1.5×105个细胞(重悬于250μL PBS)添加到750μL 1.3%低熔点琼脂糖。取100μL添加到1%琼脂糖载玻片，用盖玻片覆盖。将载玻片在4℃下孵育5min以使琼脂糖固化。除去盖玻片，细胞在4℃下用pH=10的裂解液(2.5mol/L NaCl, 0.1mol/L EDTA-Na2,10mmol/L Tris和1%Triton-X)裂解1h。细胞裂解后，在pH=13的冷电泳溶液(0.03mol/L NaOH和2mmol/L EDTA-Na2)中25V下运行30min。室温下用蒸馏水洗涤3次，每次5min,并用2.5μg/mL碘化丙啶染色。10倍放大倍率下捕获荧光图像。使用Comet Score软件(TriTek CometScore Freeware v1.5)分析彗星。通过彗星尾巴长度计算彗尾DNA含量。

1.2.5细胞转染

将HTR-8/SVneo均匀铺于24孔板，待细胞生长密度至70%左右时进行转染，将细胞随机分为si-NC组(转染1μg si-NC)、si-lncRNA DANCR组(转染1μg si-lncRNA DANCR)和si-lncRNA DANCR+si-miR-33b组(转染1μg si-lncRNA DANCR和si-miR-33b),使用Lipo8000TM转染试剂进行转染，按十字方向轻摇混匀，CO2培养箱37℃培养6h,更换含血清的培养基继续培养。

1.2.6荧光素酶报告基因实验

使用生物信息学软件(http: //www.targetscan.org)预测lncRNA DANCR和miR-33b的靶向关系。构建lncRNA DANCR野生型质粒(WT lncRNA DANCR)。基于此，通过使用点突变试剂盒对miR-33b在lncRNA DANCR-WT上的结合位点进行突变，建立lncRNA DANCR突变型质粒Mut lncRNA DANCR。将对数期HTR-8/SVneo细胞接种于24孔板，待细胞生长密度至70%左右时，使用Lipo8000TM转染试剂，分别将lncRNA DANCR-WT或lncRNA DANCR-MUT同miR-33b mimics或miR-33b NC共同转染HTR-8/SVneo细胞。48h后，用荧光素酶测定试剂盒裂解细胞用于荧光素酶活性检测。每组重复实验3次。计算公式：相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性×100%。

1.3统计学处理

采用Graphpad priam 8.0软件，多组样本间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1低氧促进滋养细胞lncRNA DANCR表达和自噬水平升高

qRT-PCR结果显示，与常氧组相比，低氧组细胞中lncRNA DANCR表达水平升高(P<0.05),见图1A。Western blot结果显示，与常氧组相比，低氧组细胞中Beclin-1蛋白表达升高，p62蛋白表达降低(P<0.05),见图1B。

图1常氧和低氧条件下滋养细胞lncRNA DANCR表达和自噬水平比较

2.2低氧诱导滋养细胞损伤

Western blot结果显示，与常氧组相比，低氧组细胞中γH2AX蛋白表达升高(P<0.05),见图2A。彗尾实验结果显示，与常氧组相比，低氧组细胞彗尾长度增加(P<0.05),见图2B。

2.3敲低lncRNA DANCR缓解低氧导致的滋养细胞自噬水平升高

qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，si-lncRNA DANCR组细胞中lncRNA DANCR表达水平降低(P<0.05),见图3A。Western blot结果显示，与si-NC组相比，si-lncRNA DANCR组细胞中Beclin-1蛋白表达降低，p62蛋白表达升高(P<0.05),见图3B。

2.4敲低lncRNA DANCR缓解低氧诱导的滋养细胞损伤

Western blot结果显示，与si-NC组相比，si-lncRNA DANCR组细胞中γH2AX蛋白表达降低(P<0.05),见图4A。彗尾实验结果显示，与si-NC组相比，si-lncRNA DANCR组细胞彗尾长度缩短(P<0.05),见图4B。

2.5 lncRNA DANCR靶向抑制miR-33b表达

序列比对结果显示，lncRNA DANCR与miR-33b有10个邻近碱基互补，见图5A。荧光素酶报告基因实验结果显示，在WT lncRNA DANCR细胞中，转染miR-33b的细胞荧光强度低于转染miR-NC的细胞(P<0.05);而此现象在Mut lncRNA DANCR的细胞中消失，见图5B。qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，si-lncRNA DANCR组细胞中miR-33b表达水平升高(P<0.05),见图5C。

图2常氧和低氧条件下滋养细胞损伤水平比较

A:Western blot检测γH2AX蛋白表达；B：彗尾实验检测DNA损伤水平。*P<0.05 vs常氧组

图3敲低lncRNA DANCR对滋养细胞自噬水平的影响

图4敲低lncRNA DANCR对滋养细胞损伤的影响

图5滋养细胞中lncRNA DANCR和miR-33b相关性

2.6敲低miR-33b拮抗lncRNA DANCR在滋养细胞自噬中的作用

qRT-PCR结果显示，与si-lncRNA DANCR组相比，si-lncRNA DANCR+si-miR-33b组细胞中miR-33b表达水平降低(P<0.05),见图6A。Western blot结果显示，与si-lncRNA DANCR组相比，si-lncRNA DANCR+si-miR-33b组细胞中Beclin-1蛋白表达升高，p62蛋白表达降低(P<0.05),见图6B。

2.7敲低miR-33b拮抗lncRNA DANCR在滋养细胞损伤中的作用

Western blot结果显示，与si-lncRNA DANCR组相比，si-lncRNA DANCR+si-miR-33b组细胞中γH2AX蛋白表达升高(P<0.05),见图7A。彗尾实验结果显示，与si-lncRNA DANCR组相比，si-lncRNA DANCR+si-miR-33b组细胞彗尾长度增加(P<0.05),见图7B。

图6敲低miR-33b对滋养细胞自噬水平的影响

图7敲低miR-33b对滋养细胞损伤的影响

3、讨 论

胎盘是胎儿生长过程中至关重要的附属器官，是母体与胎体之间物质交换的主要场所[8]。胎盘在胚胎发育和胎盘形成的早期，需在相对缺氧的环境下发挥其功能[9]。缺氧微环境对于滋养层干细胞或祖细胞维持体内平衡、减少DNA损伤和选择性分化过程至关重要。

自噬可维持细胞稳态并调节程序性细胞死亡，其特征是细胞质中出现大量自噬液泡，内质网和高尔基体增大[10]。在妊娠期间，由于胎盘早期处于生理性缺氧和低营养状态，初代滋养细胞自噬水平显著增加，细胞损伤增加[11]。本实验中，低氧组细胞中γH2AX蛋白表达升高，彗尾长度增加，表明低氧处理可诱导滋养层细胞损伤，导致自噬标志蛋白Beclin-1表达升高，p62表达降低，提示低氧处理可上调滋养细胞自噬水平，这与文献报道一致[12]。目前研究已发现大量lncRNA,可作为人类不同疾病的生物标志物。lncRNA虽然没有编码蛋白质的能力，但可通过与miRNA竞争性相互作用以调节相关基因表达，调控疾病的发生和发展[13]。Cao等[14]证实，lncRNA Uc.187在子痫前期(preeclampsia, PE)患者中表达明显较高，导致HTR-8/SVneo细胞的生物学行为异常，从而促进PE发展。本研究发现，低氧促进滋养细胞lncRNA DANCR表达，而敲低lncRNA DANCR可缓解低氧导致的滋养细胞自噬水平升高，缓解低氧诱导的滋养细胞损伤，表明在缺氧条件下，lncRNA DANCR通过调节细胞自噬加重滋养细胞损伤。

近年来，大量研究发现miRNA在细胞自噬、氧化应激及凋亡过程中发挥重要作用，如miR-146a-5p[15]、miR-29a等[16]。miR-33b是常见miRNA,其过表达可抑制胶质瘤细胞增殖和自噬，并减少由lncRNA DANCR过表达引起的胶质瘤细胞的凋亡；相反，抑制miR-33b可逆转由lncRNA DANCR抑制引起的胶质瘤细胞增殖，自噬和凋亡减少[17]。研究报道，在胰腺癌病灶中，lncRNA DANCR与miR-33b表达呈负相关，表明lncRNA DANCR和miR-33b可能形成一个相互抑制反馈回路[18]。此外，敲低miR-33b拮抗lncRNA DANCR的促自噬功能，并逆转lncRNA DANCR对滋养细胞的损伤作用。

综上所述，本研究发现lncRNA DANCR通过靶向抑制miR-33b表达，提高细胞自噬水平，从而加重低氧诱导的滋养细胞损伤，而敲低lncRNA DANCR缓解低氧导致的滋养细胞损伤。lncRNA DANCR可能作为滋养层细胞损伤的关键生物标志物，可为滋养层细胞损伤引起的相关疾病的临床药品的开发提供一定的数据参考。

基金资助:海南省卫生健康行业科研项目(No:22A200096);

文章来源:许琳,王茹,张忠霞,等.lncRNA DANCR加重低氧诱导的滋养细胞损伤[J].现代妇产科进展,2024,33(11):824-829.