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紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞衰老相关分泌表型表达的影响

2020-07-31 276 上传者：管理员

摘要：目的探讨紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞衰老相关分泌表型表达的影响。方法不同紫杉醇浓度培养处理SKOV3细胞72h后，β半乳糖苷酶染色检测SKOV3细胞的衰老；酶联免疫吸附实验（ELISA）检测SKOV3细胞培养液中衰老细胞相关分泌表型（SASP）因子的浓度。结果 3μmol/mL的紫杉醇处理SKOV3细胞72h时，衰老细胞的比例最高为（75.31±3.16）%。与对照组相比，3μmol/mL的紫杉醇处理SKOV3细胞72h时后，细胞培养液中IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ的浓度均升高，差异有统计学意义（P均<0.01）。结论紫杉醇可诱导卵巢癌SKOV3细胞的衰老及相关分泌表型因子的表达。

关键词：
卵巢癌
紫杉醇
细胞衰老
耐药
衰老相关分泌表型
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卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤，病死率居第一[1]。其发病隐蔽，早期无明显症状，大部分患者确诊时已经发展至晚期。紫杉醇联合铂类化疗方案是晚期卵巢癌患者常用化疗方案，但化疗药物耐药已成为晚期卵巢癌患者治疗失败而死亡的主要原因之一[2]。抗肿瘤药物通过诱导细胞衰老发挥抗肿瘤作用[3]。衰老细胞新陈代谢非常活跃，能分泌大量生物活性物质，如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及生长因子等，称为衰老相关分泌表型（SASP），这些因子改变肿瘤微环境，又能促进肿瘤发展和转移引起化疗不敏感[4]。紫杉醇是卵巢癌一线化疗药物，明确紫杉醇诱导卵巢癌细胞衰老及细胞衰老相关分泌表型表达的研究，对明确紫杉醇耐药机制，提高临床化疗效果具有重要意义。

资料与方法

1.实验试剂与细胞：人卵巢癌细胞SKOV3（购自中国科学院上海细胞库）培养条件：RPMI-1640+10%FBS培养，按1∶3传代，培养环境：37℃，5%CO2及100%相对湿度。衰老检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，RPMI-1640培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。紫杉醇（PTX）购自上海金和生物技术有限公司（批号：ST201604007）。

2.SKOV3细胞衰老的检测：6孔板中以2×105/孔的密度接种SKOV3细胞，待细胞融合达80%后换液，分别用含0、1、3、5μmol/mLPTX的完全培养液培养72h后移除培养液，PBS洗涤1次，加入1mL衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色固定液室温固定15分钟。吸除固定液，PBS洗涤3次，每次3分钟。吸除PBS，每孔加入1mL染色工作液，37℃孵育过夜。于倒置显微镜下观察衰老细胞，随机选取5个视野进行拍照，计算每个视野下衰老细胞百分率。

3.酶联免疫吸附测定（ELISA）测定SKOV3培养基中主要SASP因子的浓度：3μmol/mLPTX处理SKOV3细胞72h后，按ELISA试剂盒操作说明检测培养基中主要SASP因子：白介素-1β（interleukin,IL-1β）、IL-6、IL-8、CXC趋化因子配体1(chemokineC-X-Cmotifligand1,CXCL1）、CC趋化因子配体2(chemokineC-Cmotifligand2,CCL2）以及γ干扰素（interferonγ,INF-γ）的浓度。

4.统计学处理采用Graphpadprism5.0软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料用χ±s表示，两组间比较采用非配对t检验，3组及以上样本的比较采用两两比较t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞衰老的影响：不同浓度PTX诱导SKOV3细胞72h后，显微镜下观察（图1A）显示衰老细胞形态变得扁平、胀大、颗粒增多，细胞内SA-β-gal的活性增加，SKOV3细胞发生衰老。浓度为3μmol/mL的PTX处理72h时衰老细胞的比例最高，为（75.31±3.16）%（见图1B），因此选用3μmol/mLPTX继续后续实验。

2.紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞衰老相关分泌表型的影响：3μmol/mLPTX作用于SKOV3细胞72h后，ELISA测定细胞培养液中SASP的表达，与对照组相比（加入DMSO），实验组中细胞培养液中IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2、INF-γ的浓度均升高，差异有统计学意义（P均<0.01），见表1。

图1PTX诱导卵巢癌SKOV3细胞的衰老

表1PTX作用前后卵巢癌SKOV3细胞培养液中SASP因子的表达

讨论

卵巢癌病死率高，预后差。手术为主，辅以放化疗的综合治疗是目前只要治疗手段，即便大部分患者治疗达到临床完全缓解后，仍会出现复发及转移，而化疗耐药是影响卵巢癌治疗效果的主要原因[5]。紫杉醇是卵巢癌一线化疗药物，但获得性紫杉醇耐药的产生极大地影响了肿瘤化疗的效果。目前认为微管及其相关蛋白的变化和多药耐药是导致紫杉醇耐药的主要原因[6]，基于该原因的针对性治疗尚未有效应用于临床。是否还存在其他紫杉醇耐药机制，仍需进一步研究。

细胞衰老是细胞在应激状态下发生的细胞周期阻滞状态，是阻止受损伤细胞增殖的一种不可缺少的机制。细胞衰老导致的永久性地生长阻滞说明了衰老反应至少可以在一定程度上抑制肿瘤的发展。除生长停滞外，衰老细胞在染色体和基因表达方面也有广泛的改变。这会导致一些促炎症细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等细胞分泌因子的分泌发生改变，即SASP如IL-6、IL-8、IL-1α/β、MMPs以及生长因子等，这些因子能够改变细胞微环境，激活周围细胞表面受体及信号传导通路导致多种病理状态的发生。

衰老细胞分泌的SASP可产生以下作用：(1)可改变肿瘤微环境，促进肿瘤发展和转移[7]。如IL-6、MMPs等，能够损伤上皮周围基质，促进肿瘤的浸润和转移。SASP异常分泌因子除了能够在小鼠体内刺激小鼠肿瘤细胞的生长，在体外同样可以诱导正常细胞产生恶性表型如上皮-间质转化[8]。在乳腺癌、前列腺癌中衰老的成纤维细胞促进乳腺上皮细胞、前列腺上皮细胞增殖[9]。(2)衰老细胞及其分泌的SASP可以耐受射线和化疗药物的杀伤，导致耐药发生[10]。如在卵巢癌细胞中，PTX诱导IL-6高表达，其与周围细胞表面IL-6R结合激活IL-6/IL-6R/Akt(Ser473)/STAT3/CyclinD1信号通路，从而促进上皮细胞、内皮细胞增殖行程耐药[11]。

目前尚无PTX诱导卵巢癌SKVO3细胞衰老的研究，因此，本研究用不同浓度PTX处理SKVO3细胞不同时间，最终确定浓度为3μmol/mL的PTX处理72h时SKVO3衰老细胞比例最高，当3μmol/mL的PTX处理72h时，ELISA检测发现主要SASP因子IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL1、CCL2及INF-γ的浓度均升高。研究发现，卵巢癌患者血清中高水平IL-1β参与肿瘤的进展[12],IL-8可促使卵巢癌细胞获得上皮-间质转化特性，从而增强其侵袭、迁移能力[13]。恶性黑色素瘤细胞高表达CXCR-2受体，在配体CXCL1和IL-8刺激下导致细胞增殖速度加快[14]。本实验已证明，PTX诱导的卵巢癌发生衰老并诱发细胞衰老表型的分泌，但SASP对卵巢癌细胞表型的影响，需进一步研究。

综上所述，PTX可诱导卵巢癌SKVO3细胞发生衰老的同时，SASP的表达增高，而SASP的高表达是否与卵巢癌SKVO3细胞PTX化疗耐药密切相关仍需深入研究，对SASP分子调控机制了解的深入，通过药物或者基因抑制SASP有望成为卵巢癌重要治疗手段之一。

黎雪梅,阳袁莉,刘守福.紫杉醇诱导卵巢癌SKOV3细胞衰老相关分泌表型的研究[J].中国妇产科临床杂志,2020,21(04):413-415.