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妊娠期糖尿病患者腹部皮下脂肪组织中高分子量脂联素的调控机制及表达变化研究

2020-07-31 230 上传者：管理员

摘要：目的分析妊娠期糖尿病患者腹部皮下脂肪组织中高分子量脂联素的表达变化及调控机制。方法选取2016年3月-2018年3月在华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科行剖宫产分娩的20例正常妊娠女性(正常妊娠组)和20例GDM患者(GDM组)为研究对象。应用RT-PCR方法测定脂联素多聚化相关基因mRNA表达水平，应用Westernblot检测高分子量脂联素表达水平。结果与正常妊娠组比较，GDM组脂肪组织中内质网氧化还原酶1-Lα(Ero1-Lα)、二硫键氧化还原酶A类似蛋白(DsbA-L)表达水平显著降低，内质网蛋白44(ERp44)表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。正常妊娠组和GDM组脂肪组织中高分子量脂联素表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论脂肪组织通过抑制脂联素多聚化基因Ero1-Lα、DsbA-L的表达，减少高分子量脂联素的表达，在GDM发病机制中发挥重要作用。

关键词：
发病机制
妊娠期糖尿病
脂联素
脂肪组织
高分子量脂联素
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脂联素是由脂肪组织分泌的一种脂肪细胞因子，具有调节脂质代谢、增强胰岛素敏感性、抗炎、保护心血管内皮功能和抑制动脉粥样硬化等作用，与肥胖、高血压、糖尿病、肿瘤等疾病的关系密切。脂联素在体内通常以三聚体、六聚体和高分子量多聚体等形式存在，其中高分子量脂联素活性最强[1,2,3,4,5]。多项研究[6,7,8]表明:内质网蛋白44(ERp44)、内质网氧化还原酶1-Lα(Ero1-Lα)，二硫键氧化还原酶A类似蛋白(DsbA-L)都是脂联素多聚化的相关调控基因。因此，本研究拟收集正常妊娠女性和GDM患者的腹部皮下脂肪组织，用实时定量PCR技术检测Ero1-Lα、DsbA-L、ERp44的表达，用Westernblot印迹法检测高分子量脂联素的表达，以探讨它们在GDM发病机制中的作用。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2016年3月-2018年3月在华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科行剖宫产分娩的20例正常妊娠女性(正常妊娠组)和20例GDM患者(GDM组)为研究对象。GDM的诊断标准参照第8版《妇产科学》[9]。于手术时收集腹部皮下脂肪组织，快速冻存于-80℃备用待测。本研究获得了华中科技大学同济医学院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1RT-PCR方法测定脂联素多聚化相关基因mRNA表达水平

用Roche公司提供的Trizol试剂盒从脂肪组织中提取细胞总RNA，操作按试剂盒说明进行。用PrimeScriptRTreagentKit试剂盒合成cD-NA,FastStartUniversalSTBRGreenMaster试剂盒进行实时定量PCR。扩增条件:50℃2min,95℃10min后，95℃15s,60℃1min,40个循环。相关引物见表1。

表1脂联素多聚化相关基因RT-PCR扩增cDNA引物

1.2.2Westernblot检测高分子量脂联素表达水平

剪碎脂肪组织，用免疫沉淀裂解液(北京天来生物医学科技有限公司)裂解、提取总蛋白，应用考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，计算50μg蛋白上样量。沸水中蛋白变性5min后，经10%SDS-PAGE电泳，采用电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的tris-HCl缓冲盐溶液室温封闭2h。加入一抗(高分子量脂联素兔抗人抗体，工作浓度1∶1000,BioVision公司)，4℃孵育过夜。TBST洗涤10min,3次。加入二抗(羊抗兔过氧化物酶抗体，工作浓度:1∶2000,LCBlab公司)，室温孵育2h。TBST洗涤10min,3次。进入暗室与ECL试剂(北京天来生物医学科技有限公司)反应，胶片曝光，用UVP凝胶成像系统(美国UVP公司)进行扫描和密度分析，以所测目的蛋白与β-actin的比值作为该目的蛋白的定量指标。

1.3统计学分析

本研究所得数据均采用SPSS17.0版统计学软件进行统计处理。计量资料以的形式表示，数据比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组脂肪组织中脂联素多聚化相关基因表达水平比较

与正常妊娠组比较，GDM组脂肪组织中Ero1-Lα、DsbA-L表达水平显著降低，ERp44表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2两组脂肪组织中高分子量脂联素表达水平比较

正常妊娠组和GDM组脂肪组织中高分子量脂联素表达水平分别为(0.72±0.03)和(0.38±0.02)，两组比较差异有统计学意义(t=7.83,P<0.05)。

表2两组脂肪组织中脂联素多聚化相关基因表达水平比较

3、讨论

GDM的重要生化特征和主要病理基础是胎盘生殖激素以外的胰岛素抵抗及高胰岛素血症[10]。迄今为止，GDM患者胰岛素抵抗发生的分子机制和具体环节仍然是研究热点，目前认为胰岛素抵抗产生的始发部位是脂肪组织。

脂联素是迄今为止发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子，是导致胰岛素抵抗的关键因素之一[4]。脂联素在内质网内通过3个球形结构域单体组装修饰连接成三聚体，4～6个三聚体通过胶原结构域以二硫键形成低相对分子量六聚体或高相对分子量多聚体，有全长和球形两种循环形式。脂联素的多聚化状态更容易增加胰岛素的敏感性，与胰岛素抵抗联系更紧密。与三聚体、六聚体相比，高分子量多聚体具有更高的生物学活性[11]。国内外多项研究[12,13,14,15]报道:与正常妊娠孕妇或妊娠期糖耐量受损孕妇比较，GDM孕妇血浆脂联素表达水平显著下降，这种下降最早从妊娠第11周开始出现，随着妊娠进展逐渐加重;GDM孕妇血浆脂联素表达水平下降不仅先于糖耐量受损出现，而且与胰岛素抵抗的严重程度密切相关;此外，脂联素在GDM孕妇内脏脂肪组织中的表达水平也显著降低，胎盘组织中甚至没有脂联素表达。

脂联素的多聚化表达水平受多种因素调控。ERp44和Ero1-Lα作为两个位于内质网上的分子伴侣蛋白，参与了脂联素的多聚化调控[16,17,18]。有研究[6]报道:ERp44不仅通过抑制脂联素分泌而介导胰岛素抵抗，而且能通过1,4,5-三磷酸肌醇受体介导基因转录，使脂联素处于氧化状态以便于转录后修饰过程中二硫键的形成，抑制高分子量多聚体的形成和释放。Ero1-Lα通过与ERp44竞争脂联素结合位点，促进高分子量脂联素的形成和分泌。此外，二硫键氧化还原酶A类似蛋白(DsbA-L)能降低内质网应激效应，促进脂肪细胞分泌脂联素及脂联素的多聚化表达。血浆脂联素表达水平与腹部皮下脂肪含量呈负相关，即超重或肥胖孕妇脂肪组织中脂联素水平显著降低，不仅与超重或肥胖诱导内质网应激反应有关，而且受到脂肪细胞中DsbA-L表达水平降低的影响[19]。本研究发现:与正常妊娠女性比较，GDM患者脂肪组织中Ero1-Lα、DsbA-L表达水平均显著降低，ERp44表达水平显著升高，高分子量脂联素表达水平也显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，提示脂肪组织通过抑制Ero1-Lα、DsbA-L的表达，增强ERp44的表达，进而减少高分子量脂联素的形成和释放，这种变化可能在GDM的发病机制中发挥重要作用。

目前尚未发现脂联素抵抗，因此脂联素有望成为一种新的胰岛素增敏剂。深入研究脂联素的基因转录调控机制，特别是脂联素的多聚化表达调控机制，可为GDM治疗提供新的治疗靶点。

参考文献：

[9]谢幸,苟文丽.妇产科学[M].第8版,北京:人民卫生出版社,2013:75-79.

朱颖,成章金,务秋蕾,吴敏,夏革清.妊娠期糖尿病患者腹部皮下脂肪组织中高分子量脂联素的表达变化及调控机制[J].中国妇幼保健,2020,35(14):2591-2593.