在全球范围内，宫颈癌在女性癌症死亡率中居第2位[1]。研究表明，尽管接受了标准的手术或放疗方案，仍有35%的晚期宫颈癌患者复发或发生远处转移[2]。对于这些患者，化疗的有效率只有28.0%～46.3%[3]。因此，探讨宫颈癌治疗的新方法具有重要意义。间充质干细胞（MSCs）是一种来源于中胚层的多功能祖细胞[4,5]。随着其对肿瘤细胞的趋化作用及其低免疫原性特点的发现，MSCs有望成为抗肿瘤药物的理想载体，从而实现对肿瘤细胞的靶向治疗[6]。人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）是指来源于脐带组织的一种MSCs，相比于其他组织中提取的MSCs，具有高产量、高度可扩增性和更低的免疫原性等特点[7]。然而，不同的研究对于MSCs在肿瘤细胞发生发展过程中所起的作用结论并不一致[8,9]。本研究通过构建HUC-MSCs与宫颈癌Siha细胞共培养模型，探讨HUC-MSCs对Siha细胞侵袭、迁移能力的影响及其机制。

1、材料与方法

1.1细胞来源

人宫颈癌Siha细胞株由青岛大学中心试验室惠赠。HUC-MSCs购自美国Sciencell公司。

1.2主要试剂与材料

RPMI1640培养液、胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，MesenCultMSCBasalMedium培养液购自加拿大STEMCELL公司，青链霉素双抗购自美国Gibco公司，0.4μm聚酯膜购自美国Millipore公司，CCK8试剂盒购自上海七海生物公司，总RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒及RT-PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司，PCR引物基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases-2,MMP2）、MMP9和β-actin由上海生工生物工程有限公司合成，一抗溶液β-actin、MMP2和MMP9购自英国Abcam公司，E-cadherin、Vimentin和Snail购自美国Cellsingling公司。

1.3细胞培养

人宫颈癌Siha细胞株培养于RPMI1640培养液，HUC-MSCs培养于MesenCultMSCBasalMedium培养液，于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，1～2d换液1次，待细胞覆盖瓶底80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行细胞传代或者收集细胞，见图1。

1.4共培养模型

将Siha细胞接种于6孔板上，待细胞贴壁后置入0.4μm孔径、高密度、半透明的聚酯膜，并在上层加入HUC-MSCs作为实验孔；同时，设置单独Siha细胞为对照孔，于37℃、5%CO2培养箱中共培养24h后，搜集下层Siha细胞备用。

1.5细胞增殖能力CCK8检测

分别收集实验及对照组Siha细胞，细胞计数后传入96孔板（2×103个/孔），每组设4个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养3、12、24和48h后，每孔加入10μLCCK8试剂，培养箱中继续培养1h，用酶标仪测定波长为450nm的吸光度（A）值。

1.6细胞迁移能力划痕实验检测

待Siha细胞汇合率达100%时，用200μL枪头垂直于6孔板底部所画横线划痕，PBS清洗3遍，加无血清培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，于倒置显微镜下观察并拍照（×100），利用ImageJ软件测量划痕区域宽度，并计算细胞划痕愈合率。

图1倒置显微镜观察HUC-MSCs及Siha细胞的形态特征（×100)

1.7细胞侵袭能力Transwell检测

将HUC-MSCs和Siha细胞于24孔板内共培养，HUC-MSCs接种于下室，待其细胞汇合率达70%时，Transwell小室铺细胞外基质胶，计数5×104个Siha细胞，用无血清培养液制成细胞悬液置于上室，对照组下室仅加入体积分数10%的血清培养基，24h后取出小室，对小室下层细胞用多聚甲醛固定，体积分数0.1%的结晶紫染色，于倒置显微镜下计数。

1.8实时荧光定量PCR

利用总RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计分析总RNA浓度及纯度，采用RNA逆转录试剂盒进行逆转录，c-DNA储存于-80℃保存备用，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。β-actin上游引物为5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′，下游引物为5′-ATGCCAGGGTACATGGTAAT-3′；MMP2上游引物为5′-AAGTCTGGAGCGATGTG-ACC-3′，下游引物为5′-GAGTCCGTCCTACCGTC-AA-3′；MMP9上游引物为5′-GTACCACGGCCAA-CTACGAC-3′，下游引物为5′-GAGTCCGTCCTTA-CCGTCAA-3′。

PCR扩增体系为20μL，反应条件为预变性90℃30s;PCR反应95℃5s,60℃30s，溶解曲线反应95℃15s,60℃34s,95℃15s。采用2-ΔΔCt法对mRNA的表达进行相对定量分析。

1.9蛋白质印迹实验

收集Siha细胞并裂解，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，100℃、5min使蛋白变性，将获取蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel,SDS-PAGE）电泳后转移至PVDF膜上，在5%牛血清蛋白中室温封闭2h，一抗溶液（β-actin1∶2000,MMP21∶500,MMP91∶1000,E-cadherin1∶5000,Vimentin1∶2000,Snail1∶1000)4℃孵育过夜，二抗溶液室温孵育2h，在成像系统中曝光，并用ImageJ软件对目的条带进行量化分析。

1.10统计学方法

应用SPSS20.0对数据进行统计学分析。计量资料用表示，各检测指标经Shapiro-Wilk(W）检验符合正态分布，2个独立样本间的比较采用t检验，双因素数据间比较采用两因素方差分析。检验水准α=0.05（双侧）。

2、结果

2.1HUC-MSCs对Siha细胞增殖能力影响

CCK8检测结果显示，3、12、24和48h共培养组的A值分别为0.127±0.005、0.299±0.020、0.672±0.036和1.653±0.150，正态性检验结果P值分别为0.857、0.199、0.642和0.727；对照组的A值分别为0.126±0.004、0.282±0.024、0.556±0.050和1.090±0.122，正态性检验结果P值分别为0.899、0.228、0.055和0.529；各组统计量均服从正态分布，共培养组的增殖能力高于对照组，且呈时间依赖性，F组别=425.24,F时间=62.15,F组别×时间=24.26，均P<0.001。

2.2HUC-MSCs对Siha细胞迁移和侵袭能力影响

划痕实验图2显示，共培养组的愈合率为（23.80±1.39）%，高于对照组的（10.35±0.71）%，正态性检验P值分别为0.626、0.960，服从正态分布，t=8.62,P<0.001，差异有统计学意义。Transwell实验图3显示，共培养组的穿膜细胞数为80.50±4.94，高于对照组的51.75±6.22，正态性检验P值分别为0.787、0.645，服从正态分布，t=3.62,P<0.05，差异有统计学意义。提示HUC-MSCs能够促进Siha细胞的迁移、侵袭能力。

图2HUC-MSCs对Siha细胞迁移能力的影响（×100)

图3HUC-MSCs对Siha细胞侵袭能力的影响（×200)

2.3HUC-MSCs对mRNA及蛋白表达量影响

荧光定量PCR结果显示，分别以实验组中MMP2和MMP9mRNA表达量的平均值为1个单位，与HUC-MSCs共培养后的Siha细胞MMP2和MMP9mR-NA的表达量分别为2.26±0.61、1.79±0.51，正态性检验结果P值分别为0.713、0.059，服从正态分布，tMMP2=4.59,tMMP9=3.46，均P<0.01，差异有统计学意义。

蛋白质印迹实验显示，共培养组MMP2和MMP9蛋白的相对表达量分别为1.33±0.14和1.11±0.12，高于对照组的0.73±0.07和0.85±0.08，正态性检验结果P值分别为0.059、0.207、0.678和0.926，服从正态分布，tMMP2=5.25,P<0.01,tMMP9=3.50,P<0.05，差异均有统计学意义，见图4。

2.4HUC-MSCs对Siha细胞蛋白表达量影响

蛋白质印迹实验显示，共培养组Vimentin、Snai的蛋白表达量分别为0.90±0.08和1.00±0.13，高于对照组的0.62±0.03和0.62±0.06，正态性检验结果P值分别为0.458、0.343、0.653和0.858，服从正态分布，tVimentin=8.60,tSnail=9.83，均P<0.001；而共培养组E-cadherin的蛋白表达量为0.64±0.06，低于对照组的1.50±0.10，正态性检验结果P值分别为0.479和0.694，服从正态分布，t=12.76,P<0.001，见图5。

图4蛋白印迹法检测Siha细胞中MMP2和MMP9蛋白表达量

图5蛋白印迹法检测Siha细胞中E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达量

3、讨论

MSCs是Friedenstein等[10]于1976年首次发现，其在适当的诱导条件下具有自我更新、定向分化、分泌细胞生长和免疫调节因子等功能特点。围绕MSCs在组织工程学和再生医学中应用的研究取得一定的成果[11,12,13]。近几年，有学者发现MSCs有向癌细胞定向迁移的特点[14]。这使得人们对于将MSCs作为肿瘤靶向治疗的药物载体产生了浓厚的兴趣。Cao等[15]将MSCs作为光动力疗法（photodynamictherapy,PDT）中光敏剂PS的药物载体，利用MSCs对肿瘤细胞的高亲和性，成功抑制了小鼠体内乳腺癌细胞的增殖能力。Melen等[16]应用MSCs作为瘤腺病毒载体治疗神经母细胞瘤，显示出良好的安全性和有效性。然而随着研究的深入，一些学者发现MSCs本身对肿瘤细胞的生物行为也会产生一定的作用，且对于不同的肿瘤细胞和研究方法，得出的结论并不一致。一方面MSCs在乳腺癌、肝癌、结肠癌及胃癌的发生、发展过程中起到了促进肿瘤发展的作用[17,18,19,20]。另一方面也有文献报道，MSCs抑制了神经胶质瘤、慢性粒细胞白血病和食管癌的恶性行为[21,22,23]。这些MSCs对于肿瘤发展影响相互矛盾的结果表明，MSCs在肿瘤发展过程中所起的作用及分子机制尚存争议。

本研究采用的共培养模型上下两层之间相隔一层0.4μm孔径的聚酯膜，两侧细胞不能穿过，但是可以通过此膜进行信息交流。结果显示，与HUC-MSCs共培养后Siha细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显提高，提示HUC-MSCs对Siha细胞有促进作用。林琳等[24]将HUC-MSCs与宫颈癌HeLa细胞混合后接种于裸鼠皮下，发现与HUC-MSCs可以显著促进宫颈癌HeLa细胞的生长，与本研究结果一致。然而刘世凯等[25]将宫颈癌HeLa细胞置于HUC-MSCs的条件培养基中培养，结果显示HUC-MSCs的条件培养基可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖，并且抑制的程度与间充质干细胞条件培养基的浓度呈正相关，这可能与细胞系及共培养方式的不同有关，提示细胞之间的信息交流可能在MSCs与癌细胞的相互作用中起到了重要的作用[18]。

肿瘤细胞的侵袭过程是肿瘤细胞与基质细胞及细胞外基质相互作用的结果，MMP是由肿瘤细胞分泌的，可以通过降解细胞外基质增强肿瘤细胞的侵袭能力，且与宫颈癌的预后密切相关[26,27]。其中MMP2和MMP9被证明与肿瘤细胞的侵袭、迁移能力密切相关，被认为是检测肿瘤侵袭、迁移能力的重要指标[28]。在本研究中，Siha细胞与HUC-MSCs共培养后，MMP2和MMP9的mRNA及蛋白表达水平均升高，提示Siha细胞的侵袭能力增强。近期有研究证实，MMP2和MMP9的表达可能促进了肿瘤细胞的EMT过程[29,30]。

EMT是上皮来源的恶性肿瘤侵袭转移的重要机制之一，指的是肿瘤细胞上皮细胞表型向间充质细胞表型转化的生物过程。上皮细胞呈极性排列主要依靠多种细胞粘附分子维持，当EMT发生时，E-cadherin等细胞粘附分子的表达下调，而Vimentin等间质标志物的表达上调，这使得细胞骨架成分和细胞极性发生改变，从而使上皮细胞变成具有成纤维样细胞特征的纺锤形细胞，这种变化可以减弱肿瘤细胞间的连接并获得游走能力，使其能够侵入基底部的细胞外基质（ECM），向下层组织迁移[31]。近期有研究指出，MSCs可以通过促进肿瘤细胞的EMT过程提高肿瘤细胞的侵袭、转移能力[18]。本研究选择Siha细胞为研究模型[32,33]。本研究发现，Siha细胞在与HUC-MSCs共培养后，其E-cadherin蛋白的表达明显下调，Vimentin蛋白的表达明显上调，提示HUC-MSC在与Siha细胞的共培养中促进了Siha细胞EMT的发生。Snail作为一种转录抑制因子在EMT过程中发挥着重要的作用。CHIP作为一种新型的Snail泛素连接酶，可以与Snail相互作用，诱导Snail的泛素化降解，抑制CHIP表达后可以增加Snail蛋白水平，从而诱导了卵巢癌细胞的EMT，增加了卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力[34]。Shi等[35]发现，NUP58可以通过GSK-3β/Snail信号通路促进肺腺癌细胞的EMT。本研究发现，Siha细胞在与HUC-MSCs共培养后，其Snail蛋白的表达水平明显提高，表明HUC-MSCs可能通过调控Snail表达促进了Siha细胞的EMT过程。

综上所述，HUC-MSCs能够促进宫颈癌Siha细胞的侵袭、迁移能力，这可能是通过促进Siha细胞MMP2和MMP9的表达及EMT的发生引起的。由此可见，HUC-MSCs在临床上作为药物载体靶向杀灭宫颈癌细胞的同时可能会加重宫颈癌的转移风险。因此，为了提高HUC-MSCs的安全性，需要对HUC-MSCs在宫颈癌靶向治疗中的应用进行进一步的研究。

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