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TFF3基因过表达对宫颈腺癌Hela细胞增殖、迁移、侵袭的影响及相关机制

2020-06-16 550 上传者：管理员

摘要：目的:探讨TFF3基因过表达对宫颈腺癌Hela细胞增殖、迁移、侵袭的影响及相关机制。方法:构建重组慢病毒(LV-TFF3)感染宫颈腺癌细胞系Hela,应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002及其溶剂DMSO分别处理TFF3过表达的Hela细胞。实时荧光定量PCR检测TFF3表达,CCK-8实验验证TFF3对Hela细胞增殖能力的影响,细胞划痕实验和Transwell实验检测TFF3对细胞迁移和侵袭功能的影响,Westernblot法检测TFF3过表达对PI3K/Akt/Twist1信号通路及EMT相关蛋白表达的影响。结果:重组慢病毒(LV-TFF3)感染宫颈腺癌细胞系Hela后,TFF3基因表达水平明显增高(P<0.01),细胞增殖、迁移、侵袭能力明显增强(P<0.05),p-Akt、Twist1和Vimentin蛋白表达水平明显增高,E-Cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。TFF3过表达的Hela应用LY294002处理后细胞功能明显降低(P<0.05),p-Akt、Twist1和Vimentin表达水平下降,E-Cadherin表达水平升高(P<0.05)。结论:TFF3过表达可能通过激活PI3K/Akt/Twist1信号转导通路,增强宫颈腺癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并引发EMT,促进宫颈腺癌的恶性生物学行为。

关键词：
Hela细胞
PI3K/Akt/Twist1信号通路
TFF3
妇科肿瘤
宫颈腺癌
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宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,特别在发展中国家,是恶性肿瘤中致女性死亡的重要原因之一[1]。宫颈腺癌的发病率逐年升高,发病年龄相对宫颈鳞癌年轻,放化疗效果及预后较同期鳞癌差,因此迫切需探究宫颈腺癌可能的发病机制[2,3,4]。三叶因子3(trefoilfactor3,TFF3)是由肠杯状细胞分泌的三叶因子家族(trefoilfactorfamily,TFF)的一员,参与黏膜保护和上皮修复[5]。研究表明,TFF3参与多种肿瘤的发生发展,与上皮迁移、肿瘤侵袭、凋亡耐受及远处转移密切相关[6],在结肠腺癌、前列腺腺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤的发病过程中起到重要作用[7,8,9]。TFF3上调参与PI3K、MAPK、JAK/STAT等多条信号通路的活化,而这些通路与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡密切相关[10]。关于宫颈腺癌中TFF3的作用机制鲜有报道。本课题组前期研究显示,TFF3可能与PI3K/Akt通路的关键基因Akt存在相互作用[11]。本研究通过构建TFF3过表达的Hela细胞,对其增殖、迁移及侵袭能力进行检测,并应用通路抑制剂LY294002进一步探究TFF3通过激活PI3K/Akt/Twist1通路诱发上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT),进而引起宫颈腺癌不良预后的可能机制,为宫颈腺癌的发病机理及治疗提供新的思路。

1、材料和方法

1.1主要试剂及细胞系

宫颈腺癌Hela细胞系购自上海中科院细胞典藏库,DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司,TFF3过表达重组慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司,PI3K/Akt通路抑制剂LY294002购自上海Beyotime公司,Akt、pAkt、Twist1、Vimentin一抗购自美国CST公司,E-cadherin一抗购自Abcam公司,二抗购自美国CST公司,逆转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司、qRT-PCR引物由华大基因合成、CCK-8试剂盒购自Apexbio公司、Transwell小室购自美国CORNING公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

Hela细胞系用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱培养,待细胞长至80%,胰蛋白酶消化进行传代。

1.2.2细胞感染

按慢病毒感染手册进行预实验:用完全培养基制备密度为5×104/ml的Hela细胞悬液,置96孔板中培养,24h后按浓度梯度加无血清培养基稀释的重组慢病毒,72h后荧光显微镜下观察荧光表达丰度,选择MOI值=100进行正式感染。于6孔板中培养Hela细胞,加TFF3重组慢病毒及NC空载慢病毒对照,72h后观察感染效率并收集稳转细胞。

1.2.3细胞感染鉴定

提取细胞总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)以GAPDH为内参检测各组TFF3mRNA水平。反应条件为94℃5min预变性,94℃30s,55℃45s,72℃60s,共35个循环,每份样品进行3次重复实验。

1.2.4实验分组

TFF3过表达的Hela细胞为实验组(LV-TFF3组),慢病毒对照感染的Hela细胞为对照组(LV-NC组),应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理TFF3过表达的Hela细胞为LY294002组,应用LY294002溶剂DMSO处理过表达的Hela细胞为DMSO组。

1.2.5CCK-8检测细胞增殖活性

胰蛋白酶消化收集LV-TFF3组和LV-NC组Hela细胞,用DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度为5×104/ml,按100μl/孔分别接种于96孔板,按相同浓度另铺2组LV-TFF3组的Hela细胞以备后续加LY294002及其溶剂DMSO作为LY294002组和DMSO组。每组设置10个复孔,置于37℃、5%CO2培养箱培养,待细胞贴壁后,细胞换液的同时在第3组细胞中加40μmol/L的LY294002,第4组细胞中加等量DMSO。LY294002作用24h后作为CCK-8实验的起始时间,即0h,在24h、48h、72h时每孔加CCK-8溶液10μl,孵育2h用酶标仪检测波长450nm处的吸光度值(A值),重复3次实验,取其均值绘制4组细胞生长曲线图。

1.2.6细胞划痕实验

将稳定生长的四组细胞按3×105细胞/孔接种于6孔板,每组3个复孔,细胞汇合到90%时用1mltip进行划痕,PBS清洗3遍,加2ml无血清培养基,并在第3组细胞中加40μmol/L的LY294002,第4组细胞中加等量DMSO溶液,划痕后12、24、36、48h于显微镜下观察各组细胞迁移状态并进行拍照,实验重复3次。

1.2.7Transwell侵袭实验

将细胞接种于6孔板,每组3个复孔,待细胞贴壁后在第3组细胞中加40μmol/L的LY294002,第4组中加等量DMSO溶液,24h后胰蛋白酶消化收集细胞。将Matrigel在实验前1d用无血清培养基按1∶6比例稀释到1mg/ml,在Chamber小室底部中央垂直加100μl稀释后的Matrigel,37℃温育4～5h,使其成为干胶状。用无血清培养基制备细胞悬液,取200μl(含2×105个细胞)加入上室,下室中加600μl含20%胎牛血清DMEM完全培养基,置37℃、5%CO2培养箱培养培养48h,弃小室内液体,棉棒擦拭掉膜上室面细胞,90%乙醇固定25min,PBS清洗2次后自然干燥,0.1%结晶紫染色20min,PBS清洗2次,荧光显微镜下随机选取5个视野计算穿膜细胞数,计算其均值。

1.2.8Westernblot检测蛋白表达

收集上述处理的4组细胞,RIPA裂解液:PMSF:蛋白磷酸酶抑制剂=100∶1∶1冰上裂解细胞,4℃、13000r/min离心20min,取上清,与5×SDS混合,煮5min,即为总蛋白样品。BCA法测蛋白浓度。制备凝胶板,将等浓度的蛋白上样缓冲液依次上样进行电泳和转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,TBST洗膜,一抗4℃孵育过夜,分别孵育Akt(1∶1000,CST)、p-Akt(1∶1000,CST)、Twist1(1∶1000,CST)、E-Caherin(1∶10000,Abcam)、Vimentin(1∶2000,CST)、β-actin(1∶1000,NOVUS),平衡室温1h,TBST洗膜,二抗(1∶2000,CST)室温孵育2h,TBST洗膜,ECL试剂盒进行显影,实验重复3次,ImageJ软件对条带进行分析,计算各目的条带相对内参的表达量。

1.3统计学处理

采用SPSS17.0软件统计。数据以x±s表示,采用独立样本t检验;组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验;CCK-8实验数据比较采用Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1Hela细胞感染LV-TFF3

TFF3慢病毒感染后72h后,于荧光显微镜下观察到Hela细胞感染效率约为80%～90%。

2.2TFF3过表达后Hela细胞中TFF3mRNA表达水平

qRT-PCR结果显示,TFF3-Hela中TFF3mRNA水平明显升高(P<0.01),可进行后续实验。应用LY294002处理TFF3-Hela后,细胞中TFF3mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1TFF3过表达和应用LY294002后各组mRNA表达水平

2.3TFF3过表达对Hela细胞增殖活性的影响

CCK-8实验结果显示,TFF3过表达的Hela细胞增殖活性较阴性对照组显著增强(P<0.05),TFF3过表达的Hela细胞应用LY294002处理后,细胞增殖活性较TFF3-Hela减弱,差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2TFF3过表达和应用LY294002对细胞增殖的影响

2.4TFF3过表达对Hela细胞迁移、迁移能力的影响

细胞划痕愈合实验结果显示,LV-TFF3组Hela细胞的迁移能力较LV-NC组明显增强(P<0.05),应用LY294002处理后TFF3-Hela细胞的迁移能力明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。Transwell实验结果显示,LV-NC组、LV-TFF3组、DMSO组和LY294002组的侵袭细胞数分别为25±3.981、59±2.955、45±4.265、28±2.647。LV-TFF3组的Hela细胞侵袭能力高于LV-NC组、LY294002组,差异有统计学意义(P<0.05)。

图3TFF3过表达和应用LY294002对细胞迁移的影响

2.5TFF3过表达激活PI3K/Akt通路调控下游分子引起EMT

Westernblot实验结果显示,LV-TFF3组的Hela细胞磷酸化Akt(pAkt)蛋白水平明显上升(P<0.01),通路抑制剂处理后pAkt蛋白水平随之下降(P<0.01),但仍高于LV-NC组。TFF3-Hela中PI3K/Akt通路下游信号分子Twist1蛋白表达水平升高,上皮标记蛋白E-Caherin表达水平下降,间叶标记蛋白Vimentin表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。TFF3-Hela应用LY294002处理后,Twist1、E-Caherin、Vimentin蛋白表达变化量较LV-TFF3组减弱,差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4TFF3过表达和LY294002处理后蛋白表达情况

3、讨论

近年来,宫颈腺癌在宫颈恶性肿瘤中所占的比例逐年上升,且呈年轻化趋势显著。宫颈腺癌起源于宫颈管柱状上皮细胞,早期症状不典型,患者诊断时多为中晚期[2],且腺癌细胞体积大,肿瘤病灶大,局部浸润早,淋巴结转移迅速,对放疗及全身化疗抵抗,预后较宫颈鳞癌差[12]。因此,探讨宫颈腺癌可能的发病机理及寻找潜在的治疗靶点具有十分重要的意义。本课题组前期研究利用基因表达数据库GEO进行了差异基因分析,筛选出了腺癌、鳞癌可能的差异表达基因TFF3[13,14]。TFF3(三叶因子家族蛋白3)是由肠杯状细胞分泌的一类小分子多肽[5],既往研究表明,TFF3能削弱细胞间黏附、降解细胞内基质,从而促进上皮细胞的迁移,为其参与上皮肿瘤细胞的播散、血管形成及肿瘤侵袭创造条件[15]。研究指出,TFF3参与胃癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等多种肿瘤的进展及转移,且在胃癌、结肠癌中TFF3可作为独立的预测指标用于疗效监测和预后评估[8,9,16,17,18,19]。有报道认为,TFF3过表达可抑制Hela细胞系的凋亡,促进细胞增殖和侵袭[20]。本研究构建了TFF3过表达的慢病毒载体,将其感染宫颈腺癌细胞系Hela,结果表明TFF3的过表达可提高Hela细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进宫颈腺癌的恶性进展。

研究表明,TFF3可激活PI3K/Akt信号转导通路,使Akt发生磷酸化进一步活化下游信号分子[21],作为碱性螺旋-环-螺旋家族转录因子的Twist1,其表达上调可通过Akt实现丝氨酸磷酸化,显著关联PI3K/Akt信号通路,影响肿瘤发生、发展及侵袭、转移[22]。Twist1能够独立抑制E-钙黏蛋白表达、上调波形蛋白,引发EMT(上皮间质转化),而EMT即上皮细胞极性及细胞间黏附丧失并重塑细胞骨架的过程,肿瘤细胞由此获得较强的迁移与侵袭能力,成为肿瘤浸润转移的开始[23,24]。Rehana等[25]提出,在上皮间质转化过程中,上皮来源标记蛋白如E-Cadherin、Claudin表达下调,间叶来源标记蛋白如Vimentin、N-Cadherin表达上调。本研究结果显示,TFF3过表达的Hela细胞中p-Akt、Twist1、Vimentin蛋白水平较对照组升高,E-Cadherin表达水平下降,提示TFF3可能通过Akt磷酸化活化下游分子Twist1引发EMT。研究还发现,TFF3过表达的Hela细胞在应用LY294002处理后,p-Akt、Twist1、Vimentin、E-Cadherin蛋白明显减弱,提示PI3K/Akt通路受抑制后转录因子Twist1表达水平下降,抑制了EMT进程。

综上所述,TFF3过表达可能激活PI3K/Akt信号通路并活化下游转录因子Twist1,诱发EMT,增强宫颈腺癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭能力,进而参与宫颈腺癌的发展及浸润转移等恶性生物学行为,提示其可能作为一个新的靶点用于阐述宫颈腺癌的发病机理及疗效和预后监测。但该研究仍需进行TFF3基因敲减进一步证实其靶向作用,更多相关信号通路及下游靶点有待探索和验证,为宫颈腺癌的早期诊断及有效的靶向治疗提供思路和基础。

参考文献：

[11]徐昕,于风胜,殷广洁.TFF3激活PI3K/Akt通路参与宫颈腺癌的发病机制[J].现代妇产科进展,2019,28(4):246-249.

[12]黄艮平,栗宝华.宫颈腺癌的病因学研究进展[J].国际妇产科学杂志,2019,46(1):104-108.

刘海梅,于风胜,王文杰,王雅迪,殷广洁,孙欣,王宁,王言奎.TFF3过表达促进宫颈腺癌Hela细胞增殖迁移侵袭功能及其机制研究[J].现代妇产科进展,2020,29(06):456-459.

基金:国家自然科学基金资助项目(No:81172480).