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胰岛素样生长因子-1及其受体对子宫内膜癌细胞生长的影响

2020-06-19 316 上传者：管理员

摘要：目的探究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及其受体对子宫内膜癌细胞生长的影响。方法选择人子宫内膜癌细胞株HEC-1A，实施细胞培养后分为实验组和对照组。对照组细胞不实施干预;实验组细胞外源性加入IGF-1进行干预，干预时间为1～2 d。使用Westerb blot法测定HEC-1A细胞在干预前后p IGF-1R、p IGF-2R、p PI3K和CCND1水平的变化，同时对2组细胞生长情况进行对比分析。结果 (1)实验组细胞干预后p IGF-1R、p PI3K和细胞周期蛋白D1(CCND1)水平出现明显的上升，对比治疗前差异具有统计学意义(P <0. 05);而p IGF-2R水平干预前后差异不大(P>0. 05)。同时组间对比显示实验组细胞p IGF-1R、p PI3K和CCND1水平明显高于对照组(P <0. 05)，而p IGF-2R水平组间对比差异不具有统计学意义(P> 0. 05)。(2)实验组细胞生长速度明显高于对照组细胞(P <0. 05)。结论 IGF-1能够促进子宫内膜癌细胞生长，分析其机理为IGF-1能够特定性作用于其受体，通过激活PI3K通路来促进子宫内膜癌细胞的生长。

关键词：
IGF-1
妇科肿瘤
子宫内膜癌
细胞生长
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子宫内膜癌是一类原发于子宫内膜的上皮恶性肿瘤，主要起源于内膜腺体，是女性最常见的恶性肿瘤之一，数据显示，子宫内膜癌在我国发病率仅次于宫颈癌，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%，绝经后女性为该病的高发群体，但近些年该病的发病年龄呈现年轻化趋势，在欧美国家已跃至女性生殖道恶性肿瘤首位[1,2]。子宫内膜癌的病因尚不明确，但多数研究认为不良的生活习惯、肥胖、不孕不育、激素治疗、糖尿病等会增加该病的发病率，子宫内膜癌患者典型临床症状为阴道异常出血、阴道排液、疼痛、经期延长等，该病发展较慢，转移较晚，故而总体预后良好，但复发率较高[3,4]。近些年的研究发现，子宫内膜癌患者中IGF-1及其受体呈现表达异常升高状态，且有研究指出，IGF-1及其受体表达升高与恶性肿瘤的分化、增殖、预后等呈现一定的相关性，因而IGF-1及其受体的研究对探索子宫内膜癌发病机制具有重要意义。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

实验使用子宫内膜癌细胞株HEC-1A购自上海一研生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

二甲基亚砜购自沧海动力精细化工有限公司，胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶购自赛默飞世尔科技有限公司，IGF-1R抗体购自艾博抗有限公司，丙烯酰胺购自上海联硕生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器

微量加样枪购自潍坊三水检验设备有限公司，高速冷冻离心机购自广州吉迪仪器有限公司，超低温冰箱购自冠森生物科技有限公司，电泳仪购自赛默飞世尔有限公司，显微镜购自上海永科光学仪器有限公司，细胞计数板购自赛默飞世尔有限公司，细胞冻存管购自赛默飞世尔有限公司，光吸收酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏

将取出的HEC-1A子宫内膜癌细胞株置入37℃的水浴锅中，轻轻晃动细胞冻存管使管内液体尽快溶解，待液体充分溶解后将细胞转移至15ml的离心管中，加入5 ml含有20%胎牛血清的DMEM培养基，置于离心机上以1 200 r/min离心3min，弃去上层清液，而后使用完全培养基沉淀细胞，对细胞进行计数并调整密度，最后接种于10 cm的培养皿中。

1.2.2 细胞培养

将复苏的人子宫内膜癌细胞株HEC-1A置入含有20%胎牛血清的DMEM培养基中培养，设置培养温度为37℃，在5%二氧化碳恒温培养箱中培养，每3 d换1次液体，每日于显微镜下观察细胞生长情况，观察细胞汇合率达到90%后，使用胰蛋白酶进行传代培养。

1.2.3 细胞传代

加入胰蛋白酶后于37℃条件下消化2～3 min，该过程中使用显微镜观察细胞解离程度，如发现细胞出现变圆、细胞间隙变大，则表示解离充分，此时加入4 ml 20%胎牛血清中止细胞解离，吹打培养皿底部使细胞脱离，而后将细胞悬液转移至15 ml离心管中，于1 200 r/min的速率离心3 min，弃去上层清液，留细胞沉淀并接种至新的培养皿中，每3日更换液体并观察细胞生长情况，取对数生长期细胞用于本实验，并设置对照组与实验组，对照组细胞不进行任何干预，实验组细胞使用IGF-1处理，处理时间为2 d。

1.3 观察指标及评测标准

1.3.1 子宫内膜癌细胞系蛋白质提取

分别于干预前及干预后采集实验组与对照组细胞总蛋白，具体方式如下:收集细胞后于4℃条件下使用PBS漂洗5min，反复3次，而后离心弃去PBS，使用细胞裂解液于冰浴条件下裂解30 min，期间充分混匀细胞，确保细胞充分裂解，于4℃条件下使用离心机以8 000 r/min的速率离心10 min，收集上层清液并转移至EP管中，得到总蛋白产物后使用BCA定量试剂盒进行蛋白定量分析。

1.3.2 细胞生长情况

按照上文要求将子宫内膜癌细胞HEC-1A进行分组，对照组细胞不进行特殊处理，实验组细胞使用IGF-1进行处理。待细胞培养48 h后，于细胞培养孔中加入MTT溶液，仍设置培养温度为37℃、5%二氧化碳，孵育4 h后吸除培养孔中的上层清液，再每孔中加入150μl的DMSO，而后震荡10min，于540 nm波长条件下观察各培养孔光吸收值，计算细胞生长情况。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0对采集的数据实施分析，计数资料以率(%)的形式表示，采用卡方检验，计量资料以(x±s)的形式表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组蛋白表达情况

经分析发现，实验组细胞干预后pIGF-1R、pPI3K和细胞周期蛋白D1(CCND1)水平出现明显的上升，对比治疗前差异具有统计学意义(P<0.05);而pIGF-2R水平干预前后差异不大，对比差异不具有统计学意义(P>0.05)。同时组间对比显示实验组患者pIGF-1R、p PI3K和CCND1水平明显高于对照组(P<0.05)，而p IGF-2R水平组间对比差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1各组蛋白表达情况对比(±s,ng/ml)

2.2 2组细胞生长情况

经分析对比发现，实验组干预后细胞生长速度明显快于对照组细胞，对比差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 2组细胞生长情况对比

3、讨论

宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌合称为女性生殖道三大恶性肿瘤，数据显示，我国子宫内膜癌发病率仅次于宫颈癌，好发于子宫体的内膜，主要表现形式为内膜腺癌，故而又被称为子宫内膜癌。该病进展较慢，治疗难度小，且转移较慢，故而其预后相对较好，患者5年生存率一般达80%以上[4,5]。近些年随着我国居民生活方式及饮食结构的调整，子宫内膜癌的发病率有逐年递增趋势，尤其是青年女性，如得不到及时治疗可能会对其生育造成影响[6]。目前子宫内膜癌发病机制尚不清晰，但对其发病机制的了解就有利于对子宫内膜癌患者实施有限干预，同时还能对女性实施预防性治疗，对降低子宫内膜癌发病率，提高女性生活质量具有重要意义。

近些年越来越多的研究指出IGF-1及其受体与多种恶性肿瘤的分化、侵袭及预后相关。学者秦娟等[7]通过将子宫内膜癌与子宫内膜息肉患者进行组织检测及对比发现，子宫内膜癌患者其IGF-1mRNA表达率为100%，而子宫内膜息肉患者IGF-1mRNA表达率仅为84.3%，两组对比差异明显，该学者认为通过对IGF-1及其mRNA的检测能够提高子宫内膜癌早期检出率，为疾病诊断提供新思路。学者唐勇民等[8]也通过对不同病变期子宫内膜癌患者进行对比分析发现，子宫内膜癌患者IGF-1及IGF-1R表达率明显高于良性子宫内膜病变患者，同时低分化、Ⅲ期及病灶转移患者其IGF-1及IGF-1R表达要明显高于中高分化、Ⅰ+Ⅱ级及未发生转移患者，对比差异明显，提示IGF-1不仅在子宫内膜癌患者中呈现较强的表达，同时还与肿瘤恶化程度的增加及病灶转移呈现一定相关性。

本文作者通过设立实验组与对照组的方式，就IGF-1及其受体对子宫内膜癌细胞生长的影响进行了探究，结果显示，接受IGF-1干预的实验组子宫内膜癌HEC-1A细胞中pIGF-1R、p PI3K和CCND1水平相较于干预前出现明显的上升，且相比于未使用IGF-1干预的对照组细胞也明显升高，对比差异具有统计学意义(P<0.05);同时本文研究结果还显示经IGF-1干预后子宫内膜癌HEC-1A细胞生长速率明显提升，明显高于对照组细胞。结合其他学者的研究结果可以发现，IGF-1具有促进子宫内膜细胞异常增生的效果，当IGF-1与其受体IGF-1R结合后，能够触及子宫内膜细胞快速增殖，对癌细胞来讲能够维持其无限增殖状态，保持其恶性表型。本文分析显示，IGF-1在子宫内膜癌的发生发展中均发挥重要的作用。学者吴波等[9]的研究就指出，IGF-1能够通过调控PI3K/Akt信号通路来达到调节子宫内膜癌细胞生长、增殖、转移及凋亡的效果，而靶向抑制IGF-1及其受体能够抑制子宫内膜癌的增殖，并加快癌细胞的凋亡，缓解癌细胞转移状态。本文作者分析认为，其原因一方面与IGF-1能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的分泌进而加快癌症进程有关，另一方面与IGF-1能够使PI3K处于异常激活状态有关。学者余思云等[10]通过实验研究发现，紫草素能够加快子宫内膜癌细胞的凋亡进程，进一步分析其原因为紫草素能够通过抑制PI3K/Akt通路进而导致Akt的磷酸化，从而对Akt下游靶蛋白Bax的分泌产生影响，进而起到了诱导癌细胞凋亡的效果。学者林琼燕等[11]的研究也发现，顺铂之所以能够使子宫内膜癌细胞出现自噬现象，其原因也与顺铂能够抑制PI3K/Akt信号通路有关。本文中实验组患者接受IGF-1干预后PI3K蛋白水平升高，也佐证了上述观点。

总而言之，IGF-1能够促进子宫内膜癌细胞生长，分析其机理为IGF-1能够特定性作用于其受体，通过激活PI3K通路来促进子宫内膜癌细胞的生长。

参考文献：

[1]马新,谢虹,黄海伟.子宫内膜癌及癌前病变的流行病学调查及其危险因素分析〔J〕.中国妇幼保健,2016,31(17):3572-3574.

[2]刘岩,付文荣.子宫内膜癌临床病理特征与盆腔淋巴结转移的相关性〔J〕.实用癌症杂志,2017,32(7):1177-1179.

[3]周俭珊,叶红.HIF-1α､VEGF及HIF-1α/VEGF轴在子宫内膜癌中的表达研究进展〔J〕.海南医学,2015,8(16):2413-2416.

[4]王淑贞,王秋红.HIF-1α和VEGF在子宫内膜癌中的临床表达及相关性〔J〕.实用癌症杂志,2017,32(4):536-538.

[5]叶辉霞,李小毛,邓柳枝,等.CA125在子宫内膜癌诊断预测中的价值〔J〕.广东医学,2014,35(16):2562-2563.

[7]秦娟,李海英,寇莉.组织β-Catenin mRNA和IGF-1mRNA检测在子宫内膜癌和子宫内膜息肉疾病鉴别诊断中的应用〔J〕.临床和实验医学杂志,2017,16(5):468-471.

[8]唐勇民.VEGF､IGF-1及其受体在子宫内膜癌中的表达及意义〔J〕.现代实用医学,2015,27(7):900-901.

[9]吴波.胰岛素样生长因子-1及其受体在子宫内膜癌中的研究进展〔J〕.现代妇产科进展,2016,25(6):472-474.

[10]余思云,黄彩梅,胡国华.紫草素通过PI3K/Akt信号通路诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡〔J〕.世界中西医结合杂志,2014,9(12):1303-1306.

[11]林琼燕,生秀杰,刘娟,等.顺铂通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬〔J〕.肿瘤预防与治疗,2017,30(5):25-30.