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子宫内膜癌中膜黄体酮受体β和γ的定位及对其预后的影响

2020-06-19 306 上传者：管理员

摘要：目的：探讨膜黄体酮受体(mPR)β和γ在子宫内膜癌(EC)中的定位及对其预后的影响。方法：选择经妇产科手术治疗的EC患者60例，从术中获取EC组织样本以及癌旁组织。实时荧光定量PCR检测PAQR7、PAQR8和PAQR5基因的表达，免疫组化检测mPRα、mPRβ和mPRγ的表达及定位。结果：PAQR7和PAQR8在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(P<0.05),PAQR5在EC组织中的表达与在癌旁组织中的表达无显著差异。PAQR5在FIGO分期ⅠA患者EC组织中的表达显著高于其在其他FIGO分期患者中的表达(P<0.05)。mPRα和mPRβ在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(P<0.05),mPRγ在EC组织中的表达显著高于其在癌旁组织中的表达(P<0.05)。mPRβ在淋巴管浸润患者EC组织中的表达显著低于其在未发生淋巴管浸润患者中的表达(P<0.05)。免疫组化结果显示mPRs在EC组织和癌旁组织中的定位多样化。在癌旁组织中，mPRα和mPRβ主要定位于细胞膜，而mPRγ定位于细胞质和/或细胞核中。在EC组织中，在细胞膜和/或细胞质中检测到mPRα和mPRβ，而mPRγ仅位于细胞质中。结论：mPRs通过影响癌症的进展参与EC发病机制。mPRβ和mPRγ作为EC预后生物标志物的潜在作用还需要进一步大量样品评估。

关键词：
妇科肿瘤
子宫内膜癌
定位
膜黄体酮受体
预后
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子宫内膜癌(EC)是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一，早期症状隐匿，因此目前急需探寻有效的肿瘤标志物，为EC的早期诊断、治疗和预后提供依据，进一步提高EC患者的生存率[1]。研究表明，长期暴露于未受黄体酮或孕激素拮抗的雌激素可导致子宫内膜细胞增殖、DNA复制错误和体细胞突变增加，因此黄体酮对子宫内膜细胞具有保护作用，可作为治疗子宫内膜癌的一个选择[2]。之前的研究表明，黄体酮的基因组作用是由核黄体酮受体(nPRs)介导的，但近期的研究发现膜黄体酮受体(mPRs)介导黄体酮的快速非基因组作用[3]。人类mPRs同种型共有5种:mPRα(PAQR7),mPRβ(PAQR8),mPRγ(PAQR5),mPRδ(PAQR6)和mPRε(PAQR9)[4]。已发现mPRs同种型在多种组织及细胞系中表达，包括子宫内膜、子宫肌层、胎盘、脑、正常和癌性乳腺组织、T-调节淋巴细胞、乳腺癌细胞系和卵巢癌细胞系[4]。虽然已在子宫内膜组织中检测到mPRα，mPRβ和mPRγ[5]，但mPRs在子宫内膜疾病中的功能尚未完全探索清楚。本研究通过检测60例EC组织和邻近癌旁组织样本中PAQR7、PAQR8和PAQR5基因的表达，以及mPRα，mPRβ和mPRγ的表达及定位，旨在评估mPRs作为EC预后生物标志物的潜在作用。

1、材料与方法

1.1患者及样本采集

收集2016年3月至2019年3月在河南圣德医院妇产科手术治疗的EC患者60例，术中获取EC组织样本以及癌旁组织(癌实质外2cm处组织)，所有样本均经2名病理医生确诊(形态学和免疫组织化学)，样本取得后，立即用灭菌锡箔纸包裹，并置于液氮速冻，-80℃保存直至定量PCR分析。这些患者的EC组织及癌旁组织的蜡块获取于河南圣德医院病理科。从患者的病例中获取临床数据，从病理科获取病理资料。患者平均年龄(61.8±12.4)岁;平均体重(79.6±22.5)kg;平均身高(163.6±4.7)cm;平均BMI(30.5±6.9)kg/cm2;绝经状态:未绝经23例，已绝经37例;组织学分类:子宫内膜样腺瘤44例，浆液性腺癌6例，粘液性腺癌2例，未分化癌2例，癌肉瘤1例;肌层浸润:50%的38例，≥50%的20例;淋巴管浸润22例，淋巴管未浸润36例;FIGO分期:ⅠA期42例，ⅠB期11例，Ⅱ期2例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例。(组织学类型、肌层浸润及淋巴管浸润中剩余病例为未分类或未浸润)。

本研究涉及的临床和组织病理学参数包括:肿瘤的组织学类型和分级、绝经状态、国际妇产科联合会(FIGO)疾病分期、子宫肌层浸润深度和淋巴管浸润。

1.2实时荧光定量PCR

采用Trizol试剂从60例患者的EC组织样本以及癌旁组织中提取总RNA，采用SuperscriptⅣ反转录酶合成cDNA第一链，然后采用SYBRGreenⅠMaster进行实时定量PCR扩增，引物由上海生工公司设计并合成。采用2-△△Ct计算目的基因的表达。β-actin为内参。试剂盒均购自美国Invitrogen公司。

1.3免疫组化

将从病理科收集的EC患者的EC组织及癌旁组织的蜡块用切片机切为5μm的切片并放置于载玻片上，然后经脱水脱蜡后，置于H2O2中孵育30min封闭内源性过氧化物酶。之后置于柠檬酸钠缓冲液中，微波加热30min进行抗原热修复。用5%的胎牛血清在湿盒中室温封闭1min，孵育一抗，37℃封闭过夜，孵育二抗，室温1min，然后采用DAB试剂染色8min，光镜下观察染色结果，中性树胶封片。每个样本随机选取5个视野，在400倍镜下观察组织病理特征，并用ImageProPlus软件分析各蛋白表达的平均光密度值(IOD)，计算相对表达量。

1.4统计学分析

所有数据均采用(x±s)表示，用SPSS22.0进行统计学分析。2组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1编码mPRs的基因在EC组织及癌旁组织中的表达

如表1所示，PAQR7和PAQR8在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(P<0.05),PAQR5在EC组织中的表达与在癌旁组织中的表达无显著差异。此外，PAQR5在FIGO分期ⅠA患者EC组织中的表达显著高于其在其他FIGO分期患者中的表达(P<0.05),PAQR7和PAQR8的表达在这两类患者中无统计学差异(P>0.05)。PAQR7、PAQR8和PAQR5在淋巴管浸润患者EC组织中的表达与其在未发生淋巴管浸润的患者中的表达对比无统计学差异(P>0.05)。

表1编码mPRs的基因在癌旁组织及EC组织中的表达及与临床特征的关系(±s)

2.2mPRs在EC组织及癌旁组织中的表达

如表2所示，mPRα和mPRβ在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(P<0.05),mPRγ在EC组织中的表达显著高于其在癌旁组织中的表达(P<0.05)。mPRβ在淋巴管浸润患者EC组织中的表达显著低于其在未发生淋巴管浸润患者中的表达(P<0.05),mPRα和mPRγ的表达在这两类患者中无统计学差异(P>0.05)。mPRα、mPRβ和mPRγ在FIGO分期ⅠA患者EC组织中的表达与其在其他FIGO分期患者中的表达对比无统计学差异(P>0.05)。

表2mPRs在癌旁组织及EC组织中的表达及与临床特征的关系(x±s)

2.3mPRs在EC组织中的定位

免疫组化结果显示，在60例患者的癌旁组织中，有58例mPRα以膜结合形式呈现，剩余2例的mPRα定位于胞质。在60例患者的EC组织中，仅有28例的mPRα以膜结合形式呈现，10例在胞质，其余22例在细胞膜及细胞质中均有。

同样，mPRβ大部分定位于癌旁组织的细胞膜上，仅有1例在胞质，3例在细胞膜及细胞质中均有。在60例患者的EC组织中，有25例mPRβ定位于膜上，有8例在胞质，剩余27例未见染色。

在60例患者的癌旁组织中，有15例mPRγ定位于核内，5例在胞质，37例的mPRγ在核内和胞质中均有，3例未见染色。在60例患者的EC组织中，有58例的mPRγ在胞质，仅剩余2例在核内。

3、讨论

迄今为止，大多数关于mPRs的研究都集中在mPRα上，只有少数研究检测了mPRβ和mPRγ的表达和功能。研究已经表明，mPRα、mPRβ和mPRγ参与分娩、乳腺发育、卵巢、甚至癌症等多种女性生殖过程及妇科疾病的发生发展过程，还参与PI3K/Akt、MAPKs等多种信号通路。对乳腺癌细胞的研究显示，mPRs介导多种孕激素的作用，并以此方式参与癌细胞的存活、进展和转移等过程[6]。在黄体酮受体阴性的乳腺癌细胞系中，黄体酮干预可激活p42/44丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，降低细胞死亡，增加线粒体膜电位和蛋白激酶B(Akt)活性，这表明黄体酮可通过mPRs抑制乳腺癌细胞凋亡[6]。此外，mPRs可能通过黄体酮刺激的细胞增殖和癌症干细胞的产生参与促进正常乳腺组织的肿瘤前进展[7]。mPRα在上皮-间质转化中具有负调节作用，并且抑制晚期乳腺癌的侵袭和转移[8]，这两个过程都是由PI3K/Akt途径介导的。mPRα还可使黏着斑激酶去磷酸化，以及下调基质金属蛋白酶9的下游细胞信号途径，来调节黄体酮对MB231Br细胞(脑转移基底表型乳腺癌细胞系)和A549细胞(肺腺癌细胞系)迁移和侵袭的抑制作用[9]。

虽然许多研究已经涉及mPRα在妇科肿瘤中的作用及机制，但是mPRβ和mPRγ在妇科肿瘤中的作用及其与预后的关系还极少有研究涉及，本研究主要探讨mPRs在EC中的表达及定位，并分析其与EC预后的关系。本研究数据显示PAQR7(编码mPRα)和PAQR8(编码mPRβ)在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达，而PAQR5(编码mPRγ)的表达没有变化。而且可以看出，不管是在癌旁组织中还是在EC组织中，PAQR7和PAQR5的表达占优势。有些研究得出了相反的观点，PAQR8是正常子宫内膜组织中最丰富表达的同种型[5]。尽管这两种相反的观点可能是由PAQR7和PAQR5引物识别的不同转录物的变异引起的，但是这些结果不能直接比较，因为本研究不包括正常子宫内膜组织。免疫组化对mPRα、mPRβ和mPRγ在EC组织和癌旁组织中的表达显示，mPRα和mPRβ的表达与其对应的编码基因的表达一致，即mPRα和mPRβ在EC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达。但mPRγ的表达与其编码基因的表达不一致，mPRγ在EC组织中的表达显著高于其在癌旁组织中的表达。因此mPRγ在EC中可能存在转录后修饰调控，但具体的调控作用及机制还需要进一步的研究验证。

mPRs与EC预后的分析显示，PAQR5表达降低的EC患者具有更高的FIGO分期，这支持PAQR5高表达有利于EC患者的预后[10]。mPRβ表达降低的EC患者具有更强的淋巴管浸润，肿瘤淋巴管浸润的发生是淋巴结转移的前提，因此mPRβ低表达与EC转移抑制有关。综合上述结果推断mPRβ和mPRγ高表达可能有利于EC患者的预后，其可通过某种尚未知晓的机制组织EC的进展。但是本研究由于患者数量较少，且未做随访，因此这个推断还需要进一步的大样本量研究。但是根据我们的研究结果可以推测，在子宫内膜和EC中这些黄体酮受体间接介导细胞迁移和侵袭抑制过程。

关于mPRs的膜定位存在相互矛盾的证据。虽然已经在EC组织和癌旁组织的细胞膜中检测到mPRα和mPRβ，mPRγ在核内和胞质均有，但缺乏辅助蛋白，这些辅助蛋白可确保mPRs向膜传递信号[11,12]。相较于癌旁组织，EC组织中mPRα和mPRβ膜定位的例数显著降低，而mPRγ定位于胞质的例数也显著增加。这种定位的改变可影响mPRs的功能，进而可能有助于EC的发展。mPRs之间定位的差异也表明其会涉及多种细胞内信号传导途径的激活。但具体的信号转导机制还有待进一步研究。

总之，EC组织中mPRα和mPRβ在mRNA和蛋白质水平的表达均降低，而mPRγ的表达仅在蛋白质水平上增加。PAQR5和mPRβ的高表达有利于EC患者的预后。但是mPRβ和mPRγ作为EC预后生物标志物的潜在作用还需在大量样本中进一步评估。

参考文献：

[1]李冉红,岳驰.肿瘤标志物在子宫内膜癌诊断和预后评估中的研究进展〔J〕.中华妇幼临床医学杂志(电子版),2016,12(4):484-488.

陈忠平,赵立霞,张家勇.膜黄体酮受体β和γ在子宫内膜癌中的定位及对其预后的影响[J].实用癌症杂志,2020,35(06):871-874.