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分析宫颈组织标本中Nodal的表达及临床意义

2020-06-20 312 上传者：管理员

摘要：通过检测Nodal在宫颈临床标本中的表达,探索Nodal与宫颈癌发生、发展进程是否相关。收集正常宫颈(NC)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈浸润癌(ICC)组织标本,利用免疫组织化学检测并统计Nodal在宫颈组织中的表达。结果显示:Nodal在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈浸润癌组织中的阳性表达率分别为46.81%(22/47)、50%(2/4)和79.41%(54/68),经χ2检验,Nodal表达在正常宫颈和宫颈浸润癌之间有明显差异,具有统计学意义(P<0.001);免疫反应评分(IRS)分析也发现,Nodal的IRS评分呈现逐渐上升趋势,NC(3.574±0.520)、CIN(4.250±2.72)和ICC(6.912±0.490),方差分析结果显示具有统计学意义(P<0.001)。结果表明:Nodal的表达在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈浸润癌中的表达逐渐上升,Nodal在宫颈癌发生、发展过程中可能起着一定的作用。

关键词：
Nodal
女性高危疾病
妇科疾病
宫颈癌
组织
表达
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宫颈癌(CC,cervical cancer)是女性中最常见的恶性肿瘤,发病率及死亡率在全球女性中均位于第4位[1]。2014年我国宫颈癌大约有10.2万新生病例,3.1万死亡病例[2]。近年来,宫颈癌的研究出现了突破性进展,HPV感染作为宫颈癌的首要病因已经得到肯定,但是发病原因及机制尚不明确[3]。

Nodal属于转化生长因子β(TGF-β,transforming growth factor-β)超家族成员之一,作为早期胚胎诱导信号的关键成分,是胚胎干细胞发育、诱导胚胎组织形成完整体轴中的重要调节因子,参与了中胚层和内胚层之间的形成、前-后体轴位置的确定和左-右体轴的特化等一系列关键性事件,在脊椎动物早期发育过程中具有重要作用[4,5,6]。Nodal与肿瘤的关系密切,参与调节肿瘤细胞的发生发展、侵袭转移及血管生成,并维持胚胎干细胞及肿瘤细胞多向分化的潜能性[7]。目前已在多种肿瘤组织及细胞株中检测到Nodal的存在,如神经胶质瘤、恶性黑色素瘤、乳腺癌、肝细胞癌和前列腺癌等[8,9,10,11,12],并发现Nodal在恶性肿瘤中随着病理分级的增加而表达上调,因此推测其可能与肿瘤恶性程度有关。但Nodal蛋白在宫颈癌组织中的表达目前还未见报道,研究主要通过免疫组织化学探索Nodal在宫颈癌组织中的表达。

1、材料与方法

1.1主要材料及试剂

Anti-Nodal抗体(Abnova,美国),柠檬酸(Sigma,美国),柠檬酸三钠(Sigma,美国),冰乙酸(广东汕头市西陇化工厂,中国),羊抗鼠(兔)SP试剂盒(武汉博士德公司,中国),二氨基联苯胺(DAB,diaminobenzidine)显色剂(北京中山生物技术有限公司,中国),苏木素(Sigma,美国),其余常规化学试剂(西安化学试剂厂,中国)。

1.2标本收集

47例正常宫颈(NC,normal cervix),4例宫颈上皮内瘤变(CIN,cervical intraepithelial neoplasia)及68例宫颈浸润癌(ICC,invasive cervical carcinoma)组织于2008年1月—2013年8月收集自西安交通大学第一附属医院及西安交通大学第二附属医院妇科因子宫肌瘤及宫颈癌住院患者。宫颈癌患者年龄在31～71岁之间,患者术前经活检确诊,术前均未接受放化疗治疗,行广泛全子宫切除保留或不保留卵巢+盆腔淋巴结清扫术。组织一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定,另一部分置于DMEM培养基(10% FBS,10×抗生素)中,半小时内送回实验室做进一步处理。

1.3免疫组织化学

将固定后的组织经石蜡包埋,以5μm厚度进行切片,按照常规免疫组织化学法进行[13]。简单步骤如下:63～65℃干燥箱中过夜烤片,脱蜡,水化,柠檬酸钠修复液中进行热修复,PBS洗涤,3% H2O2封闭,洗涤,4℃湿盒过夜孵育一抗(Nodal,1∶100,阴性对照:以PBS代替一抗进行孵育),洗涤后孵育二抗,DAB显色,复染,脱水,透明,封片。观察拍照:在光学显微镜下,根据阳性细胞数和细胞染色强度进行免疫染色评分并拍照。阳性细胞百分率等级评分如下:<10%(0);10%～25%(1);25%～50%(2);50%～75%(3);≥75%(4);染色强度等级评分如下:阴性(0);弱阳性(1);中阳性(2);强阳性(3)。最终评分计算公式为:免疫反应评分(IRS,immunoreactivity score)=阳性细胞百分率评分×染色强度评分,总评分>3定义为阳性染色。

1.4统计分析

所有资料经统计软件GraphPad Prism V5.01分析,结果都以均值±标准差(Mean±SEM)展示,2组及3组之间IRS及计数资料采用卡方检验,P<0.05为有统计学意义。

2、结果分析

2.1 Nodal在宫颈组织标本中的表达

免疫组织化学对收集的宫颈组织标本进行染色,其中正常宫颈47例,宫颈上皮内瘤变4例,宫颈浸润癌68例。染色结果如图1所示,Nodal在宫颈组织中的阳性表达率及染色免疫反应评分如图2所示。由图1可知,Nodal主要在细胞浆、细胞核中表达;由图2可知,Nodal在正常宫颈\,宫颈上皮内瘤变以及宫颈浸润癌中的表达逐渐升高。

图1正常宫颈\,宫颈上皮内瘤变以及宫颈浸润癌组织中Nodal免疫组化染色

图2 Nodal在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈浸润癌中的表达

Nodal在NC\,CIN及ICC中的阳性表达率分别为:NC为46.81%(22/47)、CIN为50%(2/4)\,ICC为79.41%(54/68)。经χ2检验,Nodal在正常宫颈和宫颈浸润癌之间有明显差异,具有统计学意义(P<0.001)。分析免疫反应评分也发现,Nodal的IRS评分呈现逐渐上升趋势,分别为NC(3.574±0.520)、CIN(4.250±2.72)和ICC(6.912±0.490),方差分析结果具有统计学意义(P<0.001)。

研究结果都表明,Nodal蛋白在宫颈癌组织中的表达是增加的,随着宫颈癌的进展,Nodal的表达呈现逐渐上升趋势,结果显示Nodal在宫颈癌发生、发展过程中可能起着一定的作用。

3、讨论

Nodal在大多数成人组织中不活跃,但其再表达和信号传导与多数类型的人类肿瘤相关,Nodal已成为肿瘤生长和细胞可塑性的驱动因素[14]。为了研究Nodal在宫颈癌发生发展中的作用,利用免疫组织化学方法分别检测Nodal在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变以及宫颈浸润癌组织中的表达。Nodal蛋白表达阳性率在正常宫颈组织中为46.81%(22/47),在宫颈上皮内瘤变中为50%(2/4),在宫颈浸润癌中为79.41%(54/68)(P<0.001)。Nodal蛋白免疫染色的IRS评分在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变以及宫颈浸润癌中也是逐渐上升的(P<0.001)。这些结果都表明,Nodal蛋白表达随着宫颈癌病变的进展呈现逐渐升高的趋势,Nodal在宫颈癌发生、发展过程中起着一定的作用。由于宫颈上皮内瘤变组织数量较少,IRS标准差较大,但是在正常宫颈和宫颈浸润癌中的差异毋庸置疑。

李媛媛,李宏,周智辉,杨文婷,郑鹏生.Nodal在宫颈组织标本中的表达及临床意义[J].甘肃科学学报,2020,32(03):46-49.

基金:陕西省自然科学基础研究计划项目(2019JQ-871);咸阳市科学技术局推广计划(2018KT-26);陕西中医药大学学科创新团队项目(2019-YS03).