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铁死亡相关风险评估模型在宫颈癌研究中的应用

2024-07-09 74 上传者：管理员

摘要：目的构建铁死亡相关风险评估模型，探讨铁死亡对宫颈癌生存期的影响，并预测靶向的微小RNA(miRNA)。方法首先通过FerrDb、MSigDB数据库及已有的研究中定义一个新的铁死亡相关基因数据集，下载TCGA、GEO数据库中宫颈癌数据进行差异分析，筛选出差异表达(DE)的铁死亡相关基因。其次，用LASSO Cox回归分析构建风险评分模型，根据风险评分中位值将TCGA数据库中的宫颈癌患者分为高、低风险2组。用Kaplan-Meier分析、受试者工作曲线、临床病例特征以及免疫分析对评分模型预测进行评估。最后，通过miRDB、TargetScan、StarBase数据库预测潜在调控目的基因的miRNA。结果在宫颈癌组织中共获得28个DE铁死亡相关基因。高风险组患者的总体生存期更短(0.76年vs 1.00年，P<0.001),具有更高水平免疫抑制细胞的浸润。宫颈癌组织中铁死亡相关基因角鲨烯环氧化酶(SQLE)的表达显著升高。通过数据库预测得出，miR-579-3p可能调控SQLE的表达。结论本研究构建了用于预测宫颈癌预后的铁死亡基因风险评分模型，筛选出潜在的miRNA——miR-579-3p,调控宫颈癌组织中铁死亡相关基因SQLE的表达。

关键词：
miR-579-3p
宫颈癌
微小RNA
角鲨烯环氧化酶
铁死亡
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宫颈癌严重危害女性健康，尽管疫苗可预防大部分人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)相关病例，但低收入地区的发病率仍高[1]。限于检测技术和低筛查率，我国大多数宫颈癌患者确诊时已至中晚期[2]。铁死亡作为调节性细胞死亡方式，通过铁依赖的脂质过氧化作用影响肿瘤生长和药物耐药[3,4],与宫颈癌发展密切相关[5]。此外，微小RNA(microRNA,miRNA)在调控铁死亡和肿瘤发展中扮演着关键角色[6],但铁死亡相关miRNA在宫颈癌中的作用尚不明确。本研究用TCGA和GEO数据库，构建了铁死亡相关基因(Ferroptosis-related genes, FRGs)的宫颈癌预后预测模型，发现角鲨烯环氧化酶(squalene epoxidase, SQLE)是潜在靶点，随后揭示了可能调控SQLE的miRNA,为宫颈癌治疗提供了新视角和靶点。本研究有助于理解宫颈癌的发病机制，同时也为临床治疗决策提供了科学依据，特别是在针对铁死亡通路的治疗策略和miRNA相关疗法上。

一、材料与方法

1 数据的收集与处理

基因表达矩阵、临床病理特征和预后信息于TCGA数据库(https: //portal.gdc.cancer.gov/)中获取。排除临床病理特征或随访信息缺失病例后，收集到3例正常宫颈癌组织和305例宫颈癌组织。基因表达矩阵来源于GEO数据库(GSE9750、GSE138080),并进行log2转化后处理。

2 FRGs的筛选

本研究从全球第1个依靠人工整理的铁死亡数据库FerrDb(http: //www.zhounan.org/ferrdb/),有良好注释和利用GSEA软件分析汇总的基因集合的MSigDB数据库，以及对既往已发表的4篇研究报道中的铁死亡基因集的统计[7,8,9,10]这3个资源库中提取数据，构建并定义了一个新的FRGs集。

3 FRGs风险模型的构建与评估

用R软件中“limma”包分析FRGs的差异表达，差异倍数大于2,且P<0.05时被认为2组间的基因表达水平在统计学上差异有统计学意义，即差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。然后用LASSO Cox回归分析构建风险评分模型，纳入转铁蛋白受体(transferrin receptor, TFRC)、SQLE、双氧化酶1(dual oxidase 1,DUOX1)、花生四烯酸12-脂氧合酶12R型(arachidonate 12-lipoxygenase, 12R type, ALOX12B)、脯氨酸4-羟化酶β亚基(prolyl 4-hydroxylase subunit beta, P4HB)5个基因。计算每个患者的风险评分，并根据中位值分为高风险组和低风险组。用“ggplot”和“Rtsne”R包进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和t分布随机近邻嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding, t-SNE),对不同风险组的分离模式进行可视化。

4 风险评分模型的评估

用PCA分析和t-SNE分析来验证风险评分模型的分层。通过预后信息和基于Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。用R软件中“survminer”R包比较2组间的总体生存期，然后绘制1、3、5年的受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线，评估风险评分模型预测预后的灵敏度和特异度。

5 免疫分析

从3个方面评估FRGs风险评分与肿瘤免疫微环境之间的关系。首先，通过FRGs风险评分模型，根据评分高低得到高、低风险组。其次，比较高、低风险组之间不同免疫细胞浸润水平的差异。最后，用单样本(single sample, ss)GSEA分析，比较2组间免疫相关通路的激活情况。

6 miRNA的预测

用miRDB、TargetScan、StarBase3个miRNA数据库对靶基因进行miRNA的预测，最后将结果取交集。

7 统计学处理

用“RStudio”软件4.2.1、Perl软件进行统计分析。

二、结果

1 FRGs数据集的构建

在FerrDb数据库中获取了265个驱动铁死亡的基因、280个抑制铁死亡的基因、3个标记铁死亡的基因以及101个未分类的基因，去除重复基因之后，获得FRGs 448个。在MSigDB数据库中获取到了包含64个FRGs的铁死亡集合。在纳入的4篇铁死亡相关研究中报道的基因379个。将上述这些基因汇总并去除重复，构建了包含528个基因的全新FRGs数据集。

2 FRGs风险评分模型的构建

在TCGA数据库中，共有305例宫颈癌组织、3例正常组织，临床病理信息见表1。

癌组织中有171个铁死亡相关DEGs, 其中98个上调、73个下调。在数据集GSE9750和GSE138080中分别有2 417(1 194上调、1 223下调)和3 441(777上调、2 664下调)个DEGs。3个数据集中获取的DEGs取交集，获得铁死亡相关DEGs共28个：羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylg-lutaryl-CoA reductase, HMGCR)、晶状体蛋白αB

表1 TCGA数据库中宫颈癌患者的临床病例信息

(crystallin alpha B,CRYAB)、TFRC、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding protein 1,PEBP1)、SQLE、花生四烯酸15-脂氧合酶B型(arachidonate 15-lipoxygenase type B)、DUOX1、溶质载体家族38成员1(solute carrier family 38 member 1)、ALOX12B、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A、脂蛋白1、中性粒细胞胞质因子2、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶3、微管解聚蛋白、核糖核苷二磷酸还原酶、有丝分裂激酶、helicase、解旋酶、肿瘤抑制基因、糖原合酶激酶3β、核受体亚家族4A组成员1、P4HB、NEDD4样E3泛素蛋白连接酶、类固醇受体、聚(ADP-核糖)聚合酶家族成员1、聚(ADP-核糖)聚合酶家族成员12、驱动蛋白家族成员20A、调味增强子同源物2、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶14。

用Cox回归分析，筛选出与总体生存期相关的基因，其中4个基因与预后风险增加相关[HMGCR、TFRC、SQLE、P4HB,风险比(hazard ratio, HR)均>1],2个基因与预后风险减少相关(DUOX1、ALOX12B,HR均<1)。随后通过LASSO回归分析，构建了1个基于FRGs的风险评分模型，并根据以下公式计算每个患者的风险评分：FRGs风险评分=0.193×(TFRC Exp.)+0.293×(SQLE Exp.)+(-0.222)×(DUOX1 Exp.)+(-0.123)×(ALOX12B Exp.)+0.257×(P4HB Exp.)。然后根据风险评分中位值3.86分，分为高风险组152个患者、低风险组153个患者。最后用PCA和t-SNE,对不同风险组的分离模式进行可视化分析，结果见图1A～C。

3 FRGs风险评分模型的评估

用Log-Rank检验比较总体生存期的结果显示，高风险组的总体生存期更短(0.76年 vs 1.00年，P<0.001;见图1D),其1、3、5年ROC曲线的曲线下面积(area under curve, AUC)分别为0.720、0.741、

图1 评估宫颈癌患者风险评分模型的分组效果及其对预后的影响

0.735,这表明风险评分模型对于患者预后的预测作用具有高灵敏度和高特异度(见图1E)。

用ssGSEA分析，计算每个患者的免疫评分，比较免疫细胞浸润水平以及免疫通路激活情况，结果表明，低风险组患者肿瘤组织中B细胞、NK细胞、CD8+ T细胞的浸润水平显著升高，促炎通路、细胞毒性通路激活，以上结果提示低风险组患者多处于免疫激活状态，对机体的抗肿瘤免疫敏感，因此低风险组患者预后更好，总体生存期更长(见图2)。

4 SQLE的表达与宫颈癌患者的预后

在本研究中，该风险评分模型识别出5个与铁死亡相关的风险基因，其中SQLE在宫颈癌组织中的显著高表达与短暂的总体生存期和不良预后相关(见图3)。通过miRDB、TargetScan、StarBase数据库分析，本课题组预测了4个可能调节SQLE mRNA翻译

图2 评估高、低风险组患者免疫细胞浸润和免疫通路激活状态差异

图3 宫颈癌组织中角鲨烯环氧化酶(SQLE)表达水平及其与总体生存期关系的展示

三、讨论

随着HPV疫苗的普及以及检查手段的增加，HPV相关宫颈癌发病率已大为减少，但是仍有至少2/3的宫颈癌患者，在确诊时已是进展期，限制了临床上治疗方案的选择。研究表明，促进肿瘤细胞的铁死亡是治疗的手段之一，因此铁死亡在治疗中的作用成为研究热点[12]。此外，miRNA、lncRNA等也在肿瘤的进展、转移过程中发挥着重要作用[13]。JIANG等[14]用铁死亡相关的lncRNA构建了一个预测宫颈癌预后的风险评分模型，可以准确地预测患者免疫细胞的浸润水平、总体生存期等。在本研究中，通过构建FGRs风险评分模型，以及生物信息学预测miRNA,探索FGRs及其相关miRNA在宫颈癌中的作用。

本研究中，首先共收集了528个FGRs, 并通过TCGA和GEO数据库筛选到28个DEGs。用LASSO回归模型构建风险评分模型，结果发现，预后评估模型具有高灵敏度、高特异度的特点，其1、3、5年ROC曲线AUC分别是0.720、0.741、0.735,可以有效地预测宫颈癌患者的总体生存期。预后评估模型能够评估不同风险评分患者的免疫状态，低风险组患者具有更高水平杀伤性免疫细胞的浸润，包括B细胞、NK细胞、CD8+ T细胞。

在参与构建模型的基因(TFRC、SQLE、DUOX1、ALOX12B、P4HB)中，SQLE同时也是胆固醇代谢中重要的限速酶，在肿瘤的进展中作为原癌基因发挥作用。由于SQLE参与胆固醇代谢，其在非酒精性脂肪性肝病所致的肝癌中表达水平也较高，与不良预后相关，可作为防治该疾病的新靶点[15]。本研究对TCGA中的测序数据进行分析，结果发现，SQLE在宫颈癌组织高表达，与总体生存期短相关。然而，这些结果也只是基于公共数据库的分析，SQLE促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭、转移能力的机制需要进一步的细胞或动物实验证实。宫颈癌的进展、转移与多种miRNA相关，本课题组通过生物信息学方法预测发现了4种可能调控SQLE的miRNA,其中miR-579-3p显示出比较强的相关性。有证据显示，在多种癌组织中miR-579-3p的表达水平显著降低[16,17],并且与肿瘤进展、转移、耐药相关。后续将通过双荧光素酶实验、免疫沉淀等方法验证miR-579-3p对SQLE的调控作用。

本研究提示：本课题组成功构建了一个基于铁死亡相关的风险评分模型，提供了5个与宫颈癌预后密切相关的基因，风险评分模型不仅可以有效地预测宫颈癌患者的总体生存期，也可以有效预测患者的免疫状态。5个与宫颈癌预后密切相关的基因中，尤其是SQLE,在宫颈癌组织中高表达，随后通过miRDB、TargetScan、StarBase数据库发现了潜在调控SQLE的miRNA——miR-579-3p,从而为宫颈癌的分子靶向治疗提供了一个新的潜在靶点。

参考文献:

[3]王怀涛,高峰,谭晓冬.鲁斯可皂苷元通过诱导铁死亡对胰腺癌细胞的抑制作用研究 [J].中国临床药理学杂志,2022,365(15):1787—1791.

[6]牛正宣,周丽,周大新.miR-760靶向调节黑色素瘤抗原家族 D1 抑制胃癌细胞增殖､迁移及侵袭的研究 [J].中国临床药理学杂志,2023,39(4):493—497.

[12]张学松,宋毓飞,康锦钰,等.荜茇酰胺导致胃癌细胞铁死亡的作用研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(10):1280—1283.

[13]陈芹,曹达魁,高景蓬,等.LncRNA ZFAS1对NCI-H460细胞增殖､侵袭及化疗敏感性的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(22):2702—2706.

基金资助:山西省科技创新计划基金资助项目(2022L672);

文章来源:李培莉,文丽芳.铁死亡相关风险评估模型在宫颈癌研究中的应用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1953-1957.